乙型肝炎病毒蛋白對(duì)肝細(xì)胞炎性反應(yīng)及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫反應(yīng)系統(tǒng)在抵抗乙型肝炎病毒(HBV)感染中發(fā)揮重要作用。作為肝臟最主要的組成，肝細(xì)胞在肝臟免疫調(diào)控中可能發(fā)揮了主導(dǎo)作用。本課題研究了HBV蛋白表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控及其作用機(jī)制，為闡明HBV蛋白與肝細(xì)胞在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用提供了研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、構(gòu)建HBV蛋白表達(dá)重組載體，轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞。通過(guò)熒光PCR研究肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞內(nèi)炎性效應(yīng)分子在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化趨勢(shì)，利用酶聯(lián)免

2、疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)來(lái)研究炎性效應(yīng)分子在蛋白水平的表達(dá)變化情況;
　　2、利用Western Blot和免疫熒光試驗(yàn)，借助特異的信號(hào)通路抑制劑，研究HBV蛋白引起的炎性效應(yīng)中涉及到的信號(hào)通路及其作用;
　　3、構(gòu)建HBV核心抗原(HBc)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，檢測(cè)HBc在細(xì)胞增殖中的作用;
　　4、轉(zhuǎn)染siRNA研究肝癌細(xì)胞內(nèi)HMGB1在HBc促細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用，結(jié)合Wester

3、n Blot技術(shù)，研究涉及到的信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　1、HBV大蛋白(LHBs)和HBc能夠上調(diào)AIM2、IL-1β、IL-18、IL-6和TNFαmRNA等炎性基因的表達(dá);中蛋白(MHBs)能夠上調(diào)AIM2、IL-6和TNFα mRNA的表達(dá);小蛋白(SHBs)除引起TNFα表達(dá)量上調(diào)外，對(duì)其它基因的表達(dá)無(wú)影響。在SMMC-7721、L-02和Huh7細(xì)胞中，LHBs、HBc和MHBs組IL-6表達(dá)量上調(diào)且在24小時(shí)

4、達(dá)到高值。在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中，MHBs和HBc組TNFα表達(dá)量在轉(zhuǎn)染6小時(shí)時(shí)達(dá)到高值，隨后下降，在Huh7和L-02細(xì)胞中，變化趨勢(shì)與此相反。在Huh7細(xì)胞中，MHBs上調(diào)HMGB1的表達(dá)，且在24小時(shí)達(dá)到高值，在L-02和SMMC-7721細(xì)胞中，隨時(shí)間延長(zhǎng)，MHBs組HMG1的表達(dá)量逐漸下降;
　　2、MHBs激活MAPK p38/NF-κB以促進(jìn)IL-6的表達(dá)和分泌，這種效應(yīng)依賴(lài)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力;在Huh7細(xì)

5、胞中，MHBs活化NF-κB來(lái)上調(diào)HMGB1的表達(dá)，且引起HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì);
　　3、HBc通過(guò)激活MAPK p38、ERK1/2和NF-κB來(lái)促進(jìn)IL-6的表達(dá)和分泌，但此效應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力無(wú)關(guān);在Huh7細(xì)胞中，HBc激活NF-κB以促進(jìn)HMGB1的表達(dá)，但不會(huì)引起HMGB1從細(xì)胞核到胞質(zhì)的移位;HBc促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖，HMGB1 siRNA抑制HBc的促增殖作用，同時(shí)也抑制HBc對(duì)ERK1/2的激活，但對(duì)MA

6、PK p38信號(hào)通路無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　　1、同一HBV蛋白在不同細(xì)胞株中引起的效應(yīng)不一致，同一細(xì)胞株對(duì)不同HBV蛋白的反應(yīng)也不同。總體來(lái)說(shuō)，LHBs、MHBs和HBc會(huì)引起炎性基因表達(dá)的變化;除TNFα外，SHBs對(duì)肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞內(nèi)其它炎性基因的表達(dá)無(wú)顯著影響;
　　2、MHBs誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，激活p38/NF-κ B通路，上調(diào)IL-6的表達(dá)與分泌，增強(qiáng)HMGB1的表達(dá)，并導(dǎo)致其從核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，表明，MHB