基于高通量測序系統(tǒng)研究參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNAs.pdf

1、非編碼RNA是指一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括miRNAs(microRNAs，微小RNAs)，piRNAs(piwi蛋白相互作用的RNAs)，lncRNAs(long Non-coding RNAs，長鏈非編碼RNAs)，snoRNAs（small nucleolar RNAs，核糖體小RNAs）等，研究表明，這些非編碼RNA不僅在正常的生長發(fā)育和生理過程中發(fā)揮重要作用，而且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近幾年lncRNAs的作用機制

2、和功能受到了廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在維持基因組穩(wěn)定性過程中起到重要作用。
　　維持基因組的穩(wěn)定性是細胞發(fā)揮正常功能及維持生命的必要條件。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種可以對DNA造成損傷的因素存在于生物體內(nèi)部或外部環(huán)境中，這些因素會破壞基因組的穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生。DNA損傷修復(fù)能有效維持基因組穩(wěn)定性，保持基因編碼信息不變。若損傷的DNA未被及時修復(fù)，會造成維持基因組穩(wěn)定性的重要因子的功能缺失，從而引起基因組的不穩(wěn)定性和基因突

3、變，造成腫瘤抑制基因和致癌基因的突變積累，導(dǎo)致細胞生長增殖失調(diào)等細胞生理現(xiàn)象，最終引發(fā)癌癥。
　　研究表明，p53是DNA損傷應(yīng)答(DNA Damage Response，DDR)通路中重要的腫瘤抑制因子，可以維持基因組的穩(wěn)定性，避免突變發(fā)生，并在抑制腫瘤細胞生長、DNA損傷修復(fù)以及誘導(dǎo)細胞凋亡等過程中占據(jù)重要地位。在DNA損傷應(yīng)激條件下，轉(zhuǎn)錄因子p53可以激活引起細胞周期阻滯的基因或使受損傷的細胞發(fā)生凋亡，因而維持了細胞的穩(wěn)定性

4、。近年來研究顯示，lncRNAs可以維持基因組穩(wěn)定性，并在此過程中發(fā)揮重要的功能，尤其是在p53影響DNA損傷應(yīng)答信號通路中發(fā)揮了重要的功能，如Hall等人在小鼠細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21可以通過影響輔抑制物p21的表達，最終引起p53依賴的DNA損傷后凋亡?；趐53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，參與p53信號通路lncRNAs的表達和功能逐漸被人們所關(guān)注。
　　根據(jù)已有的研究，發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與p53相關(guān)的DNA損傷

5、應(yīng)答通路主要通過兩種機制，一方面，lncRNAs通過與染色質(zhì)調(diào)控因子相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制;另一方面，lncRNAs通過與組蛋白修飾激活因子結(jié)合來促進轉(zhuǎn)錄激活。由于lncRNAs在DNA損傷應(yīng)答通路中起到至關(guān)重要的作用，研究者們使用不同的策略獲得lncRNAs，并對它們表達水平進行分析，進一步研究lncRNAs在DNA損傷應(yīng)答過程中的功能。通過組蛋白修飾、染色質(zhì)調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析，可以對lncRNAs的功能進行初步分析。有研究表明

6、，果蠅中的Dmp53與人類的p53同源，保守性極高。到目前為止，在生物體水平還缺少對lncRNAs作用機制的研究，并缺少在模式生物果蠅的功能分析和機制研究，在果蠅中已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)也尚未整理分析。我們通過RNA-seq技術(shù)分析了果蠅中依賴p53的與DDR相關(guān)的lncRNAs，根據(jù)已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)信息進行統(tǒng)計分析，建立果蠅的ChIP-seq公共數(shù)據(jù)集，為深入研究lncRNAs的功能和作用機制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

7、r>　　目的:
　　獲得果蠅中與p53相關(guān)的、參與DNA損傷應(yīng)答的lncRNAs，分析已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)信息，建立果蠅中的ChIP-seq公共數(shù)據(jù)庫。
　　方法:
　　1.將野生型和p53缺失型果蠅胚胎經(jīng)過DNA損傷處理，提取RNA，進行RNA-seq測序。
　　2.對RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，獲得DNA損傷應(yīng)答過程中差異表達的lncRNAs.
　　3.搜集已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)，將已有的數(shù)據(jù)

8、進行歸納分類，得到系統(tǒng)的ChIP-seq數(shù)據(jù)體系。
　　4.構(gòu)建差異表達lncRNAs的突變gRNA質(zhì)粒。
　　結(jié)果和結(jié)論:
　　通過對RNA-seq數(shù)據(jù)的分析，獲得了169個DNA損傷應(yīng)答中差異表達的lncRNAs;運用qPCR技術(shù)對差異表達的lncRNAs表達數(shù)據(jù)進行驗證;構(gòu)建了差異表達lncRNAs的gRNA質(zhì)粒，用于建立突變果蠅，進行體內(nèi)功能研究;收集已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)信息進行歸納分析，建立以果