三種赤潮藻毒素液態(tài)芯片檢測(cè)法的建立.pdf

1、赤潮是襲擾許多沿海國(guó)家的一種常見(jiàn)的海洋災(zāi)害，已引起全世界的高度重視。赤潮藻毒素是指由有毒赤潮生物產(chǎn)生的具有毒副作用的天然有機(jī)化合物。其成分復(fù)雜，依據(jù)中毒后癥狀，毒素傳遞媒介類(lèi)型及危害性較大等因素綜合考慮，赤潮藻毒素可分為五大類(lèi)。
　　 普通免疫檢測(cè)由于受到檢測(cè)介質(zhì)和設(shè)備的限制，通常只能實(shí)現(xiàn)樣品的單項(xiàng)檢測(cè)。對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，工作人員只能采取反復(fù)檢測(cè)的手段，耗費(fèi)了大量的時(shí)間和人力。而液態(tài)芯片系統(tǒng)則可以實(shí)現(xiàn)赤潮藻毒素高通量免疫檢測(cè)。

2、在節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)也保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
　　 本文采用活性酯法和一步甲醛法合成三種赤潮藻毒素的完全抗原；并利用大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)與BSA的偶聯(lián)物OA-BSA作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，成果制備了鼠抗大田軟海綿酸(OA)單克隆抗體。隨后將三種毒素的包被抗原偶聯(lián)于液態(tài)芯片檢測(cè)載體--編碼微球上。經(jīng)過(guò)偶聯(lián)確證，證實(shí)三種赤潮抗原結(jié)合物的偶聯(lián)成功。在此基礎(chǔ)上，對(duì)每孔單項(xiàng)微球加入數(shù)、特異性生物素化抗體加

3、入量以及反應(yīng)時(shí)間等幾個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，建立3種赤潮藻毒素單通道檢測(cè)的液態(tài)芯片單通道檢測(cè)方法，分別繪制出了3種赤潮藻毒素單通道液態(tài)芯片檢測(cè)的Logistic回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)曲線(xiàn)關(guān)系良好。且三種赤潮藻毒素的單通道檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、反應(yīng)快速等特點(diǎn)。該方法針對(duì)檢測(cè)OA的有效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為0.2～63μg/L，檢測(cè)限約為0.129μg/L；針對(duì)檢測(cè)STX效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為5.04～639.58μ

4、g/L，檢測(cè)限約為4.802μg/L；而針對(duì)檢測(cè)DA效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為6.58～761.558μg/L，檢測(cè)限約為6.25μg/L；
　　 本文另一個(gè)重要研究是將R-藻紅蛋白對(duì)多種赤潮藻毒素單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，從而達(dá)到簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，最大程度的縮減檢測(cè)耗時(shí)。通過(guò)熒光物質(zhì)直接連接單克隆抗體方法所建立起來(lái)的直標(biāo)法液態(tài)芯片檢測(cè)技術(shù)較一般的液態(tài)芯片檢測(cè)法檢測(cè)時(shí)間縮短了近一半。同時(shí)保證了一定的靈敏度。該方法針對(duì)檢測(cè)OA的有效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為1.

5、32～96.87μg/L，檢測(cè)限約為1.23μg/L；針對(duì)檢測(cè)STX效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為13.34～590.79μg/L，檢測(cè)限約為12.31μg/L；而針對(duì)檢測(cè)DA效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為12.30～435.56μg/L，檢測(cè)限約為11.52μg/L；在單通道檢測(cè)法建立的基礎(chǔ)上，依次進(jìn)行3項(xiàng)赤潮藻毒素同步常規(guī)法和直標(biāo)法檢測(cè)的高通量分析。結(jié)果表明，3項(xiàng)赤潮藻毒素同步常規(guī)法針對(duì)檢測(cè)OA的有效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為0.186～94.857μg/L，檢測(cè)限約為0

6、.146μg/L；針對(duì)檢測(cè)STX效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為5.45～707.78μg/L，檢測(cè)限約為5.12μg/L；而針對(duì)檢測(cè)DA效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為6.68～696.55μg/L，檢測(cè)限約為6.35μg/L；而3項(xiàng)赤潮藻毒素同步直標(biāo)法針對(duì)檢測(cè)OA的有效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為1.45～128.27μg/L，檢測(cè)限約為1.33μg/L；針對(duì)檢測(cè)STX效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為13.67～753.46μg/L，檢測(cè)限約為12.89μg/L；而針對(duì)檢測(cè)DA效線(xiàn)性檢測(cè)范圍為

7、10.26～368.38μg/L，檢測(cè)限約為9.614μg/L；在液態(tài)芯片高通量的特異度方面，液態(tài)芯片的檢測(cè)特異度測(cè)試良好。在對(duì)含有三種赤潮藻毒素不同樣品的檢測(cè)中，實(shí)測(cè)值與實(shí)際濃度的相對(duì)偏差較小，說(shuō)明液態(tài)芯片系統(tǒng)可用于對(duì)多赤潮藻毒素實(shí)際樣品進(jìn)行快速檢測(cè)。其中常規(guī)的檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)1.5h，而直標(biāo)法僅需45min。兩種方法基本上滿(mǎn)足多赤潮藻毒素檢測(cè)的靈敏性、快速性和高通量的需求。
　　 與采用傳統(tǒng)的常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)的三種赤