細胞周期調控蛋白hcdc14A對平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、第一部分 hcdc14A在不同條件下人平滑肌等細胞中的表達變化
　　 目的：觀察hcdc14A在人平滑肌等細胞中不同干預條件下的表達變化。
　　 方法：利用XTT法和細胞動態(tài)分析儀觀察細胞在葡萄糖刺激下增殖能力的變化。分別用不同條件的高葡萄糖和胰島素干預人平滑肌細胞。此外，還應用葡萄糖，LDL以及FFA干預人巨噬細胞。提取細胞蛋白后，應用western blot法檢測細胞中hcdc14A的蛋白表達水平。
　　 結

2、果：平滑肌細胞在葡萄糖刺激下增殖能力增加。葡萄糖和胰島素干預平滑肌細胞后，hcdc14A蛋白的表達水平有所增加。不同條件干預人巨噬細胞后，hcdc14A的蛋白表達水平也有上升趨勢。
　　 結論：在糖、胰島素等條件干預下，細胞增殖能力增強，并且hcdc14A表達量有所增加，這一現象提示hcdc14A的高表達可能通過對抗Cdk/cyclin活性的增強，促進了細胞有絲分裂的退出，從而加速細胞周期進程，使細胞進入又一輪新的有絲分裂周期，

3、或者影響細胞內信號通路的傳遞，最終導致細胞的增殖增加。此外，hcdc14A的高表達還可能導致細胞正常生理功能的異常，在糖尿病血管平滑肌細胞病變中可能發(fā)揮了一定作用。
　　 第二部分 hcdc14A與細胞周期蛋白在平滑肌細胞中的相互作用
　　 目的：觀察hcdc14A與細胞周期蛋白在平滑肌細胞中的相互作用。
　　 方法：高葡萄糖、高胰島素干預平滑肌細胞后，提取細胞蛋白，應用western blot法檢測細胞周期蛋白

4、cyclinB和P53的表達。構建hcdc14A的真核表達載體，轉染細胞后觀察其定位，并檢測過表達hcdc14A后，cyclinB和P53的表達量是否有相應的變化。
　　 結果：高葡萄糖和胰島素干預平滑肌細胞后，細胞周期蛋白cyclinB和P53的表達水平均有所增加。hcdc14A的真核表達載體構建成功，其定位在細胞中心體上。過表達hcdc14A可使P53表達量增多，而cyclinB則無明顯變化。
　　 結論：Hcdc1

5、4A和cyclinB在高糖、高胰島素刺激下，可能存在相互協同的作用，分別促進細胞有絲分裂的退出和進入，對平滑肌細胞正常的有絲分裂進程有所影響。而hcdc14A一方面可使p53去磷酸化，對抗cyclin/Cdk的活性，另一方面環(huán)境刺激和hcdc14A的表達量改變也可能使細胞內突變型P53增加，影響野生型P53的作用，從而促凋亡的能力減弱。因此，細胞周期蛋白和hcdc14A在血管平滑肌細胞的病變中可能協同發(fā)揮了一定的作用。
　　 第

6、三部分 hcdc14A相互作用蛋白的驗證
　　 目的：驗證通過酵母雙雜交篩選出的與hcdc14A相互作用的蛋白Zipk。
　　 方法：構建各種真核與大腸桿菌表達質粒后，利用體外Pulldown試驗和免疫共沉淀試驗驗證hcdc14A和Zipk間的相互作用。并且兩種質粒共轉細胞后，觀察其共定位情況。
　　 結果：體外Pulldown試驗和免疫共沉淀試驗結果提示兩者確實可以相互作用，并且發(fā)現Zipk可以與hcdc14A

7、的N端(磷酸酶活性端)相互結合。hcdc14A和Zipk的表達質粒共同轉入Hela細胞后，我們觀察到兩者有共同的細胞內定位。
　　 結論：研究結果已經證實hcdc14A和Zipk有相互作用，為尋找調控hcdc14A的蛋白打下一定的基礎。而已知的Zipk蛋白的功能，可能對hcdc14A有所調控。Zipk蛋白對hcdc14A的調控作用，以及自身促進平滑肌收縮的功能可能在血管平滑肌病變中也起了一定的作用。
　　 第四部分 Zi

8、pk在平滑肌中的表達及其對hcdc14A的調控
　　 目的：觀察糖、胰島素刺激后，Zipk在平滑肌中的表達，并進一步研究Zipk與hcdc14A的相互作用。
　　 方法：構建各種質粒后，分別共轉細胞以觀察兩者定位的變化，初步判斷蛋白的相互作用。高葡萄糖、高胰島素干預平滑肌細胞后，提取細胞蛋白，利用western blot法檢測細胞Zipk的表達變化。過表達Zipk后，檢測hcdc14A的表達量是否有相應的變化。
　

9、　 結果：共轉Zipk和hcdc14A-N端(磷酸酶活性端)質粒后，Zipk改變了hcdc14A-N端在細胞內的定位，使其從細胞核上釋放到了細胞漿內。而Zipk-KD(激酶失活質粒)并不能影響hcdc14A-N端的定位。葡萄糖干預平滑肌細胞后，Zipk表達量增加。而胰島素干預之后，其表達量則有所減少。過表達Zipk可使hcdc14A的表達增加。
　　 結論：Zipk和hcdc14A的共定位可能依賴于Zipk的激酶活性，Zipk