水牛抑制素α基因RNAi載體構建與沉默效率檢測.pdf

1、抑制素(Inhibin,Inn)通過反饋作用抑制促卵泡素的合成與分泌,影響動物的卵泡發(fā)育和排卵。為探討應用RNAi技術沉默INH-α基因提高水牛繁殖力的可行性,本研究構建了水牛抑制素α亞基的RNAi載體,并在細胞水平對其沉默效率進行了檢測。
　　 1.以pSliencer4.1-CMV neo載體為骨架,設計并構建了pSliencer4.1-145、pSliencer4.1-308、pSliencer4.1-769、pSlien

2、cer4.1-1013和pSliencer4.1-1053共5個針對水牛INH-α基因的RNAi載體。載體用脂質體法轉染水牛顆粒細胞,48h后應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進行沉默效率的檢測。結果顯示:針對308、769、1013和1053位點的抑制效率分別為58.8％、44.9％、67.4％和43.9％,145位點無抑制效果。選擇抑制效率最高的pSliencer4.1-1013轉染顆粒細胞,檢測24h、48h、72h和96h

3、后的抑制效率表明基因沉默具有時效性,轉染48h后抑制效率最高,此后逐漸減弱。
　　 2.以1013位點為核心序列,設計并構建了以pSico-PGK1為骨架的RNAi慢病毒載體pSico-PGK1-CMV-1013。通過pSico-PGK1-CMV-1013、psPAX2和pCMV-VSV-G質粒共轉染293T細胞包裝病毒,經批量快速測定法(LaSRT)測定病毒滴度達到4x107 IU/mL,用病毒感染水牛顆粒細胞72h后,qRT

4、-PCR檢測INH-α的抑制效率為26.8％。
　　 3.探討了應用microRNA原理進行卵巢組織特異性沉默水牛INH的可行性。設計并構建了2個以pEGFP-C1為骨架基于內含子microRNA原理的干擾載體pEGFP-C1-18a-1013和pEGFP-C1-155-1013。轉染顆粒細胞48h后的檢測結果顯示pEGFP-C1-155-1013具有49.4％的抑制效率,而pEGFP-C1-18a-1013未表現抑制作用。