安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌的耐藥性與Ⅰ類整合子的研究.pdf

1、目的：：了解安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況，耐藥基因型別的分布，指導(dǎo)臨床合理用藥。了解新酶的生化特性，等電點(diǎn)和酶對(duì)抗菌藥物的水解特性。了解產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌Ⅰ類整合子的流行情況，以及Ⅰ類整合子中基因盒的種類。
　　 方法：安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心收集35所醫(yī)院2007年隨機(jī)月份住院和門診患者的各種臨床送檢標(biāo)本，無重復(fù)分離的E.coli共355株。全部菌株均由Microscan WalkAw

2、ay-40全自動(dòng)微生物分析儀（美國(guó)DADE公司）自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定。355株大腸埃希菌通過頭孢西丁三維實(shí)驗(yàn)篩選出確證高產(chǎn)AmpC酶菌株，以三維試驗(yàn)陽(yáng)性菌株總DNA為模板，使用blaampC通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以篩選出攜帶ampC基因菌株；將三維試驗(yàn)陽(yáng)性菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)，行全編碼引物PCR擴(kuò)增。并用瓊脂平板稀釋法測(cè)定其對(duì)13種抗菌藥物的耐藥性。對(duì)多次測(cè)序并經(jīng)GenBank比對(duì)后確定的產(chǎn)新酶菌株進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：PCR擴(kuò)增臨床分離株和/或轉(zhuǎn)移

3、接合子中的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因片段，PCR產(chǎn)物純化后克隆入pMD-18T載體，表達(dá)于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中，再次測(cè)定核苷酸序列，結(jié)果至GenBank比對(duì)，進(jìn)行DNA序列分析。將新酶全編碼基因克隆入表達(dá)載體pHSG398，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌JM109中，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂倍比稀釋法測(cè)定臨床分離株和接合子，轉(zhuǎn)化株的MIC。采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取，進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

4、研究，以初步了解新酶的動(dòng)力學(xué)特性。等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)（pI）。Southern blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解新酶是否為質(zhì)粒介導(dǎo)。PCR篩選Ⅰ類整合酶基因，進(jìn)一步檢測(cè)陽(yáng)性樣本可變區(qū)基因盒序列。檢測(cè)攜帶新型AmpC型酶菌株的整合子基因盒。
　　 結(jié)果：355株大腸埃希菌中21株大腸埃希菌三維實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，占所有臨床分離菌株的5.9％(21/355)，19株經(jīng)PCR檢測(cè)攜帶ampC基因，16株轉(zhuǎn)移接合成功，經(jīng)序列分析表明，9株CIT陽(yáng)性結(jié)

5、果，6株DHA陽(yáng)性結(jié)果，3株EBC陽(yáng)性結(jié)果；1株同時(shí)攜帶EBC及DHA。檢出一株EBC型新基因 (序列號(hào)為FJ237369)；藥敏結(jié)果顯示臨床分離菌株及接合子對(duì)多種抗菌藥物耐藥，對(duì)頭孢吡肟，亞胺培南，美羅培南敏感。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)和克隆表達(dá)試驗(yàn)均取得成功，其野生株及轉(zhuǎn)化株的MIC結(jié)果顯示：野生株和轉(zhuǎn)化株有著幾乎相同的耐藥譜，但轉(zhuǎn)化株對(duì)抗菌藥物的耐藥性有所下降。產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的等電聚焦顯示，其

6、等電點(diǎn)在8.6左右，Southern blot實(shí)驗(yàn)提示新酶為質(zhì)粒介導(dǎo)。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，初步了解新酶對(duì)5種常用抗菌藥物的Km值和Vmax值，結(jié)果顯示：該酶對(duì)頭孢西丁的水解效率最高。產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的大腸埃希菌中16株攜帶有I類整合子，14株擴(kuò)增出了可變區(qū)，經(jīng)測(cè)序基因盒為編碼磺胺類抗菌藥物耐藥的基因dhfrA17和編碼氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因aadA5，aadA1，aadB。ampC基因不在Ⅰ類整合子基因盒上。
　　 結(jié)