慢病毒介導的RNAi沉默GTPBP4基因對人結腸癌細胞HT29生物學行為影響的探究.pdf

1、目的：
　　利用pGC SIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒載體轉染人結腸癌細胞HT29，沉默GTPBP4基因，探究GTPBP4RNAi對HT29細胞生物學行為的影響。
　　方法：
　　1.慢病毒最佳感染復數(multiplicity of infection，MOI)的篩選及細胞轉染
　　慢病毒GTPBP4RNAi載體及陰性對照慢病毒載體由上海吉凱基因公司包裝完成;預實驗用慢病毒轉染人HT29細胞篩選出

2、最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI），用篩選出的最佳MOI進行正式轉染實驗。將處于對數生長期的HT29細胞分為實驗組和陰性對照組，于轉染前一天鋪板，轉染細胞72h后熒光顯微鏡下觀察GFP標記所激發(fā)出的熒光豐度，以此初步判斷細胞轉染效率。
　　2.Real-time PCR及Western blot技術檢測轉染慢病毒后GTPBP4基因mRNA和蛋白水平的沉默效率
　　(1)慢病毒轉染細胞7

3、2h后，分別提取實驗組和對照組HT29細胞總RNA，根據Takara公司逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，采用Real-time PCR檢測GTPBP4基因mRNA表達水平;
　　(2)慢病毒轉染細胞72h后，分別提取實驗組及陰性對照組總蛋白，采用Western blot檢測GTPBP4蛋白表達水平。經蛋白變性、上樣、電泳、電轉、化學發(fā)光，得到蛋白條帶并分析基因的沉默效率;
　　3.慢病毒沉默GTPBP4基因對HT29細胞生物

4、學行為的影響
　　(1)CCK-8法檢測沉默GTPBP4基因后，HT29細胞在體外增殖能力的改變：分別于細胞轉染后分板的24h、48h、72h、96h四個時間點，檢測實驗組和陰性對照組兩組細胞在體外的增殖能力。
　　(2)平板克隆形成實驗檢測慢病毒轉染細胞沉默GTPBP4基因后單個細胞體外成瘤能力的變化。
　　(3)劃痕實驗檢測GTPBP4基因沉默后，對結腸癌細胞HT29體外遷移能力產生的影響。
　　(4)Tra

5、nswell實驗檢測GTPBP4基因沉默對結腸癌細胞HT29體外侵襲能力的影響。
　　(5)PI-FACS法檢測沉默GTPBP4基因對結腸癌細胞HT29增殖周期分布的影響。
　　(6)AnnexinV-APC單染法檢測GTPBP4基因沉默后，兩組細胞凋亡率的差別。
　　4.慢病毒沉默GTPBP4基因對p53和Survivin蛋白表達量及定位的影響
　　利用Western blot和免疫熒光技術，檢測慢病毒轉染人結

6、腸癌細胞HT29沉默GTPBP4基因對p53和Survivin蛋白表達量及定位的影響。
　　結果：
　　1.MOI的篩選
　　GTPBP4RNAi轉染人結腸癌細胞HT29的MOI值為10.
　　2.慢病毒轉染HT29細胞后，GTPBP4基因mRNA水平和蛋白表達水平顯著降低。
　　(1)采用2-△△Ct法統(tǒng)計實驗組和陰性對照組中GTPBP4基因mRNA表達水平。
　　結果：顯示：實驗組GTPBP4mR

7、NA相對表達量為0.026±0.01，陰性對照組GTPBP4mRNA相對表達量為0.993±0.06，且兩組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，故GTPBP4RNAi能夠有效地抑制mRNA的表達。
　　(2)Western blot結果：在內參蛋白條帶灰度基本一致的條件下，實驗組GTPBP4蛋白條帶灰度明顯低于陰性對照組。
　　3.慢病毒沉默GTPBP4基因對HT29細胞生物學行為的影響
　　(1)CCK-8結果：在轉

8、染后分板的24h、48h、72h、96h，實驗組測得的OD值均值分別為0.77±0.01、1.06±0.02、1.64±0.02、2.01±0.06，陰性對照組OD值均值分別為0.92±0.03、1.34±0.04、2.27±0.02、3.17±0.09，實驗組OD值小于對照組，且兩組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組較陰性對照組細胞增殖指數顯著降低。
　　(2)平板克隆形成實驗：種板2周后，實驗組生成細胞集落個數均數為6

9、7.00±3.61，對照組生成細胞集落個數均數為115.70±10.02，實驗組細胞集落個數明顯少于陰性對照組，且兩組間差異具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(3)劃痕實驗：在劃痕48h后，實驗組融合平均距離為500.01±1.82PX（像素），陰性對照組融合平均距離為781.23±10.51PX（像素），實驗融合距離明顯小于陰性對照組。
　　(4)Transwell實驗：細胞接種的48h，固定染色后，實驗組穿過Matri

10、gel膠的細胞數目均數為91.40±4.39，陰性對照組穿過Matrigel膠細胞數目均數為263.80±11.90，實驗組細胞數目明顯小于陰性對照組，且兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　(5)細胞周期結果：與陰性對照組相比，實驗組處于G1的細胞數目比例顯著增加，而處于S期細胞數目明顯減少。
　　(6)細胞凋亡結果：實驗組的細胞凋亡比例明顯高于陰性對照組。
　　4.慢病毒沉默GTPBP4基因對p53和Su

11、rvivin蛋白表達量及定位的影響
　　在目的基因GTPBP4沉默的條件下，p53蛋白表達明顯上調，而Survivin蛋白表達明顯下調;熒光顯微鏡下觀察發(fā)現，實驗組與陰性對照組的p53，Survivin蛋白均在核表達，并沒有發(fā)生表達位置的改變。
　　結論：
　　1.pGCSIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒載體能夠感染人結腸癌HT29細胞，并且有效沉默GTPBP4基因。
　　2.HT29細胞GTPBP4基