PGC-1α過表達對PD模型細胞的線粒體和在體多巴胺能神經(jīng)元的影響.pdf

1、帕金森病(PD)是以黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元變形死亡為病理特征的一種神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病年齡平均為60歲。臨床表現(xiàn)為肌強直、靜止性震顫、步態(tài)和姿勢不穩(wěn)等運動障礙，以及失眠、抑郁等非運動癥狀，會嚴(yán)重影響老年人的健康。引發(fā)該病的因素包括遺傳、環(huán)境、藥物等，由這些因素導(dǎo)致的線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)聚集、炎癥反應(yīng)等是主要機制，其中線粒體功能障礙可能是重要的機制之一。線粒體是細胞的能量供給中心，同時也是生成氧自由基(ROS)的主要場所，

2、上述因素都可能使線粒體的電子傳遞鏈功能異常而生成ROS增加。ROS對細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，使DA能神經(jīng)元變形死亡而引發(fā)PD。有實驗證明，自噬-溶酶體系統(tǒng)與PD的發(fā)病有關(guān)，尤其與線粒體自噬密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）在劇烈運動時會高表達，并與線粒體的生物發(fā)生和細胞自噬/線粒體自噬密切相關(guān)，使其在骨骼肌細胞的重塑過程中起著重要作用。這提示，PGC-1α可能通過調(diào)節(jié)線粒體的自噬和生物發(fā)生

3、而對細胞的損傷有保護作用。那么，如果人為提高PGC-1α的表達，能否對MPP+損傷的DA能神經(jīng)元進行保護？其對細胞自噬/線粒體自噬有否影響？對在體DA能神經(jīng)元的損傷有否保護作用？對膠質(zhì)細胞和炎癥反應(yīng)有否影響？這些都是非常值得探討的問題。對這些問題的解明將有助于確定PGC-1α能否作為防治PD的藥物靶點提供必要的實驗證據(jù)，具有一定的理論和實際意義。
　　針對上述問題，本研究擬以SH-SY5Y細胞和C57BL/6小鼠為研究對象，用MP

4、P+誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞損傷復(fù)制PD細胞模型，通過腹腔注射MPTP復(fù)制C57BL/6小鼠的PD模型。首先采用MTT比色法、FJC染色法、Hoechst33342染色法來確定MPP+對SH-SY5Y細胞的最佳損傷條件;將細胞和動物均分為CON組、MPP+(MPTP)組、NCOE+MPP+(MPTP)組和OE+MPP+(MPTP)組;在OE+MPP+(MPTP)組，用構(gòu)建好的PGC-1α過表達慢病毒對SH-SY5Y細胞和小鼠中腦黑質(zhì)進行轉(zhuǎn)

5、染使其過表達;通過MTT比色法檢測以上四組SH-SY5Y細胞的存活率的變化，然后采用Real-time PCR來探究PGC-1α過表達后線粒體相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因mRNA水平的變化;用免疫熒光染色法來觀察中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的表達變化，從而為上述問題尋找答案。
　　實驗所得結(jié)果如下:
　　1.當(dāng)MPP+的濃度為1 mmol/L，對細胞作用時間為24 h時，細胞存活率接近50％，所以MPP+的使

6、用濃度1 mmol/L作用24 h為MPP+損傷的最適建模條件。
　　2.通過FJC染色法、Hoechst33342染色法檢測MPP+對SH-SY5Y細胞不同時間點的損傷發(fā)現(xiàn)，隨著與MPP+孵育時間的增加，細胞的凋亡率逐漸增加，說明MPP+損傷與孵育時間成正相關(guān)，由以上兩個實驗結(jié)果綜合考慮MPP+的損傷時間為24 h，濃度為1mmol/L。
　　3.利用PCR技術(shù)獲取目的基因后與線性載體進行連接，轉(zhuǎn)化，對陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR

7、鑒定，測序后與目的基因進行比對得出重組質(zhì)粒的測序結(jié)果和目標(biāo)序列一致，獲得過表達載體。
　　4.ELISA法滴度檢測NCOE和OE病毒的滴度分別為1×109 TU/ml和2×108 TU/ml。
　　5.通過MTT比色法測定PGC-1α過表達后細胞存活率，發(fā)現(xiàn)PGC-1α過表達后，細胞的存活率明顯上升。NCOE組較正常組無顯著性差異。OE組細胞的存活率較各組均有明顯升高的趨勢，且與MPP+組和NCOE組比具有極顯著的差異(P＜

8、0.01)，和CON組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　6.Real-time PCR檢測線粒體相關(guān)基因(NRF1、Drp1、Mfn2)、自噬相關(guān)基因(LC3B、p62)的表達變化。發(fā)現(xiàn)PGC-1α過表達后，NRF1 mRNA的表達也顯著升高，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。而線粒體分裂、融合基因Drp1和Mfn2的mRNA表達也明顯升高。OE組Drp1較MPP+組具有極顯著差異(P＜0.01

9、)與NCOE組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。Mfn2 mRNA的表達較MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。自噬相關(guān)基因LC3B的mRNA表達明顯降低，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。p62 mRNA的表達明顯升高，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。
　　7.對小鼠進行黑質(zhì)立體定位注射PGC-1α過表達慢病毒基因干預(yù)后，統(tǒng)計結(jié)果表明，小鼠中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元

10、的數(shù)量沒有明顯的改善，TH陽性神經(jīng)元的表達各組之間無統(tǒng)計差異。免疫熒光檢測PGC-1α的表達變化發(fā)現(xiàn)OE組PGC-1α陽性細胞數(shù)較MPTP組和NCOE組均有明顯增多的趨勢，且具有極顯著差異(P＜0.01)。尤其是在黑質(zhì)的致密部，PGC-1α陽性細胞數(shù)明顯增多。雖然在細胞數(shù)上PGC-1α的表達是升高的，但是，由免疫熒光圖片我們可觀察到PGC-1α形態(tài)較為異常，細胞變得不規(guī)則。此外，免疫熒光統(tǒng)計結(jié)果也顯示了，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了過

11、度激增的現(xiàn)象。
　　通過對上述實驗結(jié)果的分析，得出如下結(jié)論:
　　1.本研究檢測所得1 mmol/L的MPP+對SH-SY5Y細胞損傷24 h為MPP+的最適建模條件?？沙晒?fù)制出MPP+誘導(dǎo)的PD體外模型。
　　2.PD細胞模型中，過表達PGC-1α可以抵抗MPP+誘導(dǎo)的細胞毒性，抑制自噬的發(fā)生，增加MPP+損傷后NRF1的表達，提高線粒體融合基因Mfn2的表達對于改善線粒體功能，維護線粒體分裂融合的動態(tài)平衡起到了一