灘涂植物菊芋根際固氮菌群落分析及其內(nèi)生細菌作用機制.pdf

1、植物在自然界中并不是孤立存在的，而是通過自身的代謝活動等，在植物周圍環(huán)境以及植物組織內(nèi)部構(gòu)建形成特殊的植物微生態(tài)環(huán)境。植物微生態(tài)環(huán)境是植物與外界進行能量和物質(zhì)交流的主要界面，細菌是其中最主要定居者之一。植物根際土壤中的根際細菌，受到各種生物以及非生物因素的影響，在環(huán)境中形成復雜的種群結(jié)構(gòu)，了解植物根際細菌的種群結(jié)構(gòu)對實際的應用和生產(chǎn)具有重大的指導意義。植物促生細菌包括根際細菌和內(nèi)生細菌，是植物聯(lián)合細菌中的重要組成部分，主要通過生物固氮、

2、合成植物生長素、活化無機營養(yǎng)元素等作用機制，促進植物的生長發(fā)育，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應用。內(nèi)生細菌直接定殖于植物體內(nèi)的組織細胞間隙中，獨特的生長環(huán)境使之能夠避免外界不利因素的影響，并直接作用于宿主植物，是優(yōu)質(zhì)促生微生物的重要來源。內(nèi)生環(huán)境中的細菌除了要面對宿主植物之外，還能夠與其他內(nèi)生細菌甚至病原菌通過信號分子以及代謝互補等方式進行種間交流。群體感應系統(tǒng)是細菌中最為常見、研究最為廣泛的種內(nèi)以及種間交流機制之一，能夠?qū)毦?/p>

3、運動、共生、生物毒性等生理功能進行調(diào)控。
　　為了探討根際固氮細菌的群落結(jié)構(gòu)，以及其相應的影響因素，本研究針對固氮細菌特有的功能基因，優(yōu)化獲得了一種簡便快捷、重復性高的半定量分子指紋技術(shù)。從灘涂植物菊芋的根系中，分離獲得了一株具有植物促生活性的內(nèi)生細菌，并對其在宿主體內(nèi)的定殖動力學以及植物促生作用進行了深入的探索。為闡明內(nèi)生細菌在其所處微生態(tài)環(huán)境中具體的種間交流作用，本研究以油橄欖種間交流模式結(jié)構(gòu)中的內(nèi)生細菌作為研究對象，探討了群

4、體感應系統(tǒng)對細菌的具體調(diào)控作用。
　　1.在根際土壤中，難培養(yǎng)、不可培養(yǎng)以及未培養(yǎng)的固氮細菌在群落中所占的比重極大，傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術(shù)并不能夠滿足土壤固氮細菌群落的研究需要。LH-PCR(Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction)以及T-RFLP(TerminalRestriction Fragment Length Polymorphism)分子指紋圖譜的技術(shù)手段的操作簡便快捷

5、、重復性強，已經(jīng)得到了廣泛的應用。以固氮細菌中與16s rDNA進化地位相似的“分子鐘”nifH作為目的基因，本研究檢測了不同氮素水平下菊芋根際土壤中的固氮細菌群落。通過對比不同的分子指紋圖譜技術(shù)，本研究利用以限制性內(nèi)切酶MnlⅠ作為工具酶的T-RFLP技術(shù)在固氮細菌群落多態(tài)性的分析中獲得了最豐富的檢出量，并表現(xiàn)出極高的分辨率和可重復性。菊芋根際土壤中的固氮細菌受植物根系活動的影響，種屬豐度以及多樣性均顯著小于非根際土壤中的固氮細菌，表

6、現(xiàn)出了顯著的根際效應。另外，大量氮肥施用對菊芋根際固氮細菌菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和多樣性具有負面影響，從而導致根際固氮細菌種類和多樣性銳減。
　　2.從灘涂植物菊芋的根系中我們分離獲得了多株內(nèi)生固氮細菌，其中固氮酶活性最高的菌株為蒼白桿菌Ochrobactrum sp.Mn1，乙炔還原法檢測其活性，能夠達到為207.34 nmol·mL-1·h-1。Ochrobactrum sp.Mn1還具有較高的分泌IAA以及活化無機磷的特性，并能夠

7、產(chǎn)生大量的鐵載體幫助植物吸收難溶的金屬營養(yǎng)。通過溫室和大田實驗，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)生固氮細菌Ochrobactrum sp.Mn1對菊芋具有顯著的促生作用。其促生機制是多方面的，通過生物固氮，Ochrobactrum sp.Mn1能夠為宿主提供約占總氮量20％的有效氮營養(yǎng);產(chǎn)生的植物生長素能夠顯著優(yōu)化植物根系發(fā)展;利用解磷特性和分泌的鐵載體，該菌株能夠提高菊芋對P、K、Fe、Mg等營養(yǎng)元素的吸收利用。應用綠色熒光蛋白標記與內(nèi)生菌再分離技術(shù)，對O

8、chrobactrum sp.Mn1在不同植物組織部分定殖的動力學進行探究發(fā)現(xiàn)，Ochrobactrum sp.Mn1的定殖部位主要位于菊芋根系和莖的組織細胞間隙中。尤其是在根系內(nèi)部內(nèi)生細菌的數(shù)量最高，每克植物根系中約有105個內(nèi)生細菌定殖。
　　3.在假單孢桿菌Pseudomonas savastanoi pv.Savastanoi(PSV)侵染油橄欖所形成的腫瘤結(jié)構(gòu)中，AHLs(Acyl-homoserine Lactones

9、)群體感應系統(tǒng)具有極為重要的生物學作用，能夠介導病原菌與內(nèi)生細菌歐文氏菌Erwinia toletana(ET）之間的種間交流，該體系目前已經(jīng)成為研究物種間信號交流的重要模式之一。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對內(nèi)生細菌ET的深度測序我們發(fā)現(xiàn)，AHLs信號分子能夠?qū).toletana的細菌運動、質(zhì)粒接合、生物毒性、物質(zhì)轉(zhuǎn)運以及抗生素抗性等多種生理活動進行調(diào)控。除次生代謝調(diào)控之外，AHLs群體感應系統(tǒng)還能夠作用于內(nèi)生細菌對碳水化合物的初生代謝