膠原-殼聚糖-膠原-納米羥基磷灰石仿生支架復(fù)合BMSCs體外構(gòu)建組織工程骨軟骨的前期實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】1．分離、培養(yǎng)擴(kuò)增和鑒定豬BMSCs。2．構(gòu)建TGF-β1重組慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs，為骨軟骨組織工程修復(fù)提供持續(xù)高效的種子細(xì)胞。3.制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料并檢測(cè)其生物相容性。
　　 【方法】1．分離、培養(yǎng)擴(kuò)增和鑒定豬BMSCs：聯(lián)合應(yīng)用密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)擴(kuò)增豬BMSCs，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定BMSCs表面相對(duì)特異性分子(CD90、CD105、CD45）的陽(yáng)性率以明確B

2、MSCs的純度。2．構(gòu)建TGF-β1重組慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs：將已提取的目的基因TGF-β1cDNA包裝至慢病毒載體中，通過(guò)PCR及基因測(cè)序?qū)﹃?yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，并用Real-time PCR檢測(cè)慢病毒滴度；利用TGF-β1重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，通過(guò)Western blot、RT-PCR，免疫細(xì)胞化學(xué)、Elisa等方法檢測(cè)TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表達(dá)情況，以明確轉(zhuǎn)染效果。3. 制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基

3、磷灰石支架材料并檢測(cè)其生物相容性：由清華大學(xué)研發(fā)和制備出膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料，并依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)選擇急性全身毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)及骨植入試驗(yàn)檢測(cè)膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料的生物相容性。
　　 【結(jié)果】1.聯(lián)合應(yīng)用密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)擴(kuò)增豬BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面相對(duì)特異性分子的陽(yáng)性表達(dá)率顯示：CD90為91.2％，CD105為

4、93.5％，CD45為4.4％。2.經(jīng)PCR及基因測(cè)序鑒定TGF-β1重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，測(cè)定滴度為2×109TU/ml；以慢病毒為載體，將TGF-β1基因?qū)胴iBMSCs，經(jīng)Western blot、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及Elisa提示TGF-β1基因成功導(dǎo)入BMSCs，并表達(dá)TGF-β1蛋白。3. 膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料的急性全身毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)均符合相關(guān)