結(jié)腸癌及缺氧的結(jié)腸癌細胞中HIF-1α與miRNA-200b表達的相關(guān)性.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌是我國最常見的高危害消化系惡性腫瘤，它具有以下臨床特點:早期發(fā)病隱襲，并且無特殊的臨床不適表現(xiàn)，早期患者可有高達90％以上的5年生存率，然而大多數(shù)患者去醫(yī)院就診時，檢查到結(jié)腸癌已經(jīng)為進展期，5年生存率只有65％左右，手術(shù)及放化療后對其預(yù)后改善不肯定，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移其致死的主要原因，因此探求結(jié)直腸癌高危個體的早期識別、早期診斷、早期治療顯得尤其重要。研究證明低氧是實體腫瘤組織內(nèi)部普遍存在的現(xiàn)象，且腫瘤細胞的缺氧可能是

2、惡性腫瘤進展的啟動因子之一，低氧使癌細胞更具轉(zhuǎn)移性、侵襲性，而EMT（epithelial mesenchymal transition，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）決定并參與了多種腫瘤上皮細胞表型的轉(zhuǎn)變，因此在腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮著核心的作用。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變是這樣的一個過程:原發(fā)灶中靜止的腫瘤上皮細胞表型發(fā)生改變，失去細胞與細胞的黏著狀態(tài)，向具有運動遷移傾向的間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，從而賦予了腫瘤上皮細胞能夠轉(zhuǎn)移并且遠處侵襲的能力。近年研究表明

3、EMT的發(fā)生與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)，缺氧是結(jié)直腸癌最重要的微環(huán)境特點之一，HIF-1α是缺氧反應(yīng)最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。相關(guān)研究表明HIF-1α在腫瘤早期便有異常表達，不僅如此HIF-1α的異常表達和患者的術(shù)后生存率有關(guān)。所以，HIF-1α能夠作為有效的腫瘤篩查和預(yù)后標(biāo)記物，并且能夠在決定腫瘤的發(fā)生以及進展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外，我們通過對腫瘤基因中非編碼小RNA的了解，發(fā)現(xiàn)它也參與了EMT相關(guān)進程，不僅如此，非編碼小RNA在EMT

4、不同進程中起到了重要的作用。MicroRNA-200家族已經(jīng)作為一類典型的抑癌基因被廣泛關(guān)注。其特點是在惡性腫瘤組織中表達下調(diào)，能夠作為EMT進程、腫瘤細胞粘附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制物。最近的報道稱:miR-200b能夠直接抑制VEGFR（vascular endothelial growthfactor receptor，血管內(nèi)皮生長因子受體）和VEGF（vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮

5、生長因子相關(guān)基因的表達，抑制腫瘤內(nèi)微小血管的生成，進而對腫瘤細胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移過程產(chǎn)生影響。此外，腫瘤血管生成的另外一個關(guān)鍵原癌基因是轉(zhuǎn)錄因子Ets-1同樣受miR-200b的負性調(diào)控，而在低氧環(huán)中miR-200b表達顯著下調(diào)，從而促進低氧誘導(dǎo)的血管生成過程。前期已經(jīng)在結(jié)腸癌組織中證實MicroRNA-200家族在癌組織表達明顯低于正常組織，而大量文獻表明HIF-1α在癌組織中異常高表達。關(guān)于MicroRNA-200家族調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及靶

6、蛋白的研究有大量文獻報道，但其本身在轉(zhuǎn)錄水平如何被調(diào)控缺乏深入研究。因此檢測了結(jié)直腸癌和癌旁組織中HIF-1α和miR-200b的表達，并且檢測不同缺氧條件下結(jié)直腸癌細胞中HIF-1α和mi-200b的表達來探討結(jié)腸癌中HIF-1α和miR-200b之間的聯(lián)系，為確立HIF-1α-miR-200b腫瘤調(diào)節(jié)通路提供依據(jù)。
　　方法:
　　實時定量PCR檢測50例結(jié)腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織中HIF-1α與miRNA-2

7、00b的表達。利用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。利用CoCl2構(gòu)建結(jié)腸癌細胞系的缺氧誘導(dǎo)模型，通過實時定量PCR和Western blot分別測定缺氧的Caco-2細胞中HIF-1α和miRNA-200b基因表達并確立兩者相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　在癌癥組織中HIF-1αmRNA的表達量明顯高于癌旁組織中其基因的表達量，而miRNA-200b基因的表達量與正好相反，其在癌旁組織中的表達明顯高于癌組織中的表達。通過對細胞

8、模擬缺氧處理后發(fā)現(xiàn):缺氧2h的HIF-1α蛋白水平升高，而后隨缺氧時間的延長HIF-1α蛋白表達緩慢下降(2～12)h，最后HIF-1α在16h表達量最高，miRNA-200b在缺氧2h的cαco-2細胞中表達量最低，2～12小時表達逐漸上升，16h的表達量下降至2h水平。Reαl-time PCR和Western blot聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和miRNA-200b表達呈相反的趨勢。
　　結(jié)論:
　　在結(jié)直腸癌組織HI