新型抗結核先導物的篩選發(fā)現(xiàn)與分子藥理學研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌引起的嚴重危害人類健康的傳染性疾病。全世界約有三分之一的人感染結核分枝桿菌。在2014年結核病導致約150萬人死亡。雖然近兩年有新的抗結核藥物上市，但已有耐藥菌株出現(xiàn)的報道。因此仍然急需開發(fā)新機制的高效低毒的抗結核藥物。
　　氨酰-tRNA合成酶(AaRS)能夠將氨基酸和對應的tRNA合成氨酰-tRNA(aa-tRNA)，在蛋白質生物合成中起著至關重要的作用。酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）是該家族中的一

2、員，阻斷其功能就能抑制病原菌的生長繁殖。結核中的TyrRS蛋白與人體內的同源蛋白結構差異巨大，因此針對該靶點可能發(fā)現(xiàn)新的低毒高效的抗結核化合物。
　　本研究中我們利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，在體外表達純化了具有良好催化活性的結核TyrRS蛋白。在此基礎上，利用同位素方法建立了酶抑制劑篩選模型。同時使用結核分枝桿菌的近緣菌株恥垢分枝桿菌作為檢定菌建立了表型篩選體系。聯(lián)用兩種方法對本實驗室保存的10萬個化合物進行了篩選，最終發(fā)現(xiàn)了一個同

3、時具有酶抑制活性和抗結核活性的化合物IMB-T130。測定了該化合物對結核分枝桿菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)它對結核標準菌株H37Rv具有良好的抑制作用，MIC為0.08μg/mL。特別的是它對臨床分離的耐藥菌株表現(xiàn)出良好的抑制活性，強于一線抗結核藥物異煙肼和利福平。我們通過表面等離子共振(SPR)實驗在分子水平證明了化合物和TyrRS蛋白之間存在相互作用。進一步構建了TyrRS蛋白過表達的恥垢分枝桿菌菌株，發(fā)現(xiàn)對化合物敏感性降低，在細胞水平驗證

4、了化合物的靶向抑制作用。通過計算機軟件進行分子對接，我們分析了化合物與蛋白的相互作用機制。進一步對化合物細胞毒性，急性毒性和藥代動力學性質進行了檢測，結果顯示化合物毒性較小，具有良好成藥性。測定了化合物對于一系列革蘭氏陽性、陰性菌株的抗菌譜，結果顯示化合物對于結核分枝桿菌具有良好的選擇性。
　　考慮到化合物對TyrRS酶抑制活性和體外抗菌活性之間存在一定差異，我們推測該化合物可能還作用于其他重要的抗結核靶標。收集整理了已報道的結核

5、分枝桿菌關鍵蛋白結構，通過計算機軟件與IMB-T130進行分子對接，分析對接模型以尋找化合物新的作用靶標，我們推測莽草酸途徑中的3-脫氫奎尼酸合酶(DHQS)可能是IMB-T130發(fā)揮抗菌作用的另一靶標。以此為基礎，我們在體外表達純化了結核DHQS蛋白，通過孔雀綠定磷法檢測催化反應中生成的游離磷酸，建立了酶活性測定體系，在酶水平驗證IMB-T130對該蛋白具有更強的抑制作用。SPR實驗結果進一步證明了化合物和DHQS蛋白之間存在相互作用