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文檔簡介
1、非酒精性脂肪肝病(NAFLD),包含一系列從簡單的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎等臨床癥狀,甚至肝硬化[1,2]。在西方國家,NAFLD占據(jù)大多數(shù)的慢性肝病,有近30%的成年人和大多數(shù)肥胖人患有[3,4]。雖然大量的研究已經(jīng)進行,但NAFLD的具體病理原因仍然在很大程度上未知[5]。一種改進的“二次打擊”模式已經(jīng)總結出NAFLD的引發(fā)和進展,其中胰島素抵抗被認為是對肝臟的“一次打擊”,并導致接下來的打擊,包括氧化應激,炎癥,纖維化和細胞凋
2、亡的發(fā)生[6]。
經(jīng)全面匯總分析[7]和詳盡的審查[8],NAFLD的治療仍存在爭議。各種藥理學方法已被探索,主要側重于減輕重量,或者通過單純的生活方式干預或與藥物治療相結合。然而,除了持續(xù)減重,沒有其他單獨的介入已經(jīng)證明了對NAFLD的治療有明確的顯著療效[9,10],這突出表明,需要新的方法用于NAFLD的預防和治療。
白藜蘆醇(3,4',5-三羥基二苯乙烯)是一種自然的酚類化合物,存在于某些水果、蔬菜和飲料中,
3、包含紅葡萄酒。已有報告顯示白藜蘆醇具有很多的生物健康益處,包括抗氧化、抗衰老、抗癌癥、誘導自噬作用以及改善脂質代謝[11,12]。在最近的動物研究中,白藜蘆醇顯示出很有前景的效果在于保護肝臟抵抗高脂飲食誘導的脂質積聚[13-16]。其作用機制可能是通過單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制脂肪生成的相關基因(如固醇調節(jié)元件結合蛋白1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS))來預防和改善肝臟脂肪變性,最后,降低肝脂肪酸利用率。在NA
4、FLD的這些動物模型中,動物發(fā)展為肝臟炎癥,白藜蘆醇的抗炎潛力被認為是該作用效果的核心機制。然而,更多的可能機制還是一個未知數(shù)。在本研究中,通過提高肝脂質積聚的大鼠模型,我們探索白藜蘆醇在防治NAFLD方面的潛力,并深入探討白藜蘆醇對AMPK、SIRT1、SREBP-1c、FAS等基因表達的影響以及對轉錄因子SREBP-1c的轉錄活性的影響。
8周齡雄性SD大鼠110只隨機分為4組:基礎飼料對照組((C1,n=20),高脂膳食
5、組(HF1,n=70),高脂膳食加每天每kg體重50 mg RSV組(HF1RS0,n=10)和高脂膳食加每天每kg體重100 mg RSV組(HF1R100,n=10)。8周后,每組十只大鼠實施安樂死并取出肝臟和血液做后續(xù)分析。剩余HF1組大鼠被隨機分成六組,每組十只大鼠:基礎飼料對照組(HFC2),高脂膳食組(HF2),高脂膳食加每天每kg體重50 mg RSV組(HF2R50),高脂膳食加每天每kg體重100 mg RSV組(HF
6、2R100),基礎飼料加每天每kg體重50 mg RSV組(HFC2R50),基礎飼料加每天每kg體重100 mg RSV組(HFC2R100)。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后,所有大鼠實施安樂死并取出肝臟和血液做后續(xù)分析。每周稱量動物體重和食物消耗量,干預后檢測血清和肝臟中脂質含量,肝臟組織HE染色觀察脂肪變情況,Western blot檢測pAMPK、SIRT1、SREBP-1c、FAS的蛋白表達以及實時定量PCR分析SREBP-1c和FAS mR
7、NA表達,ChIP試驗分析FAS啟動子序列SRE與SREBP-1c的結合程度。
結果:
1.RSV干預對大鼠攝食量和體重的影響
通過8周的干預,HF1組大鼠體重顯著重于C1組(P<0.05),由基礎飼料轉為高脂飼料后,大鼠的攝食量出現(xiàn)了不同程度的下降,說明大鼠對不同能量密度和營養(yǎng)素組成的食物有相應的識別和自我調節(jié)能力,而RSV干預在不影響大鼠每日能量攝入的情況下能使高脂飼養(yǎng)大鼠體重下降(P<0.05)。但5
8、0mg和100mg RSV干預未觀察到劑量效應關系。
2.RSV對大鼠脂代謝影響
脂代謝紊亂被普遍認為是NAFLD的根本。 HF1組大鼠血清和肝臟中TC和TG的濃度顯著增加(P<0.05),而RSV干預能顯著削弱高脂膳食所引起的TG含量的升高(P<0.05),但RSV對TC的影響較小。
3.白藜蘆醇能有效的減輕高脂誘導的NAFLD肝臟脂肪變性
由高脂飲食誘導8周后,HF1組大鼠肝臟出現(xiàn)了大量的脂肪
9、沉積,表明NAFLD的模型建立成功。為了評價白藜蘆醇對NAFLD進展的預防效果,在給予高脂飲食的同時用白藜蘆醇干預,白藜蘆醇能夠顯著降低高脂膳食引起的肝細胞脂肪滴的沉積。進一步為了研究白藜蘆醇是否對NAFLD具有治療作用,將高脂喂養(yǎng)8周NAFLD建模成功的大鼠隨機分成六組:基礎飼料對照組(HFC2)、高脂膳食組(HF2)、高脂膳食RSV組(HF2R50、HF2R100)、基礎飼料加RSV組(HFC2R50、HFC2R100),繼續(xù)喂養(yǎng)8
10、周后,HF2組大量的肝細胞脂肪變性,且具有明顯氣球樣變。HF2組的NAS量化評分顯著高于C2組,HF2組的小葉內炎癥和纖維化程度非常高;HFC2組的NAS量化評分顯著低于HF2組,HFC2組的纖維化程度明顯降低了;HFC2R50和HFC2R100組的NAS量化評分顯著低于HFC2組,特別是HFC2R50和HFC2R100組的小葉內炎癥明顯改善;HF2R50和HF2R100組的NAS量化評分顯著高于HFC2R50和HFC2R100組,它們
11、的脂肪變性和小葉內炎癥情況相對嚴重;但只要添加了白藜蘆醇干預或者從高脂膳食轉變?yōu)檎I攀?,都會改善肝臟脂肪變性程度。NAS量化評分與H&E染色結果是一致的。這些結果表明,白藜蘆醇有效地改善由高脂飲食誘導的肝脂肪變性。
4.白藜蘆醇誘導SD大鼠肝臟中AMPK的激活,增加SIRT1的表達水平
為了驗證白藜蘆醇對肝臟的保護效應是否通過AMPK和SIRT1信號通路,進一步檢測肝臟組織中AMPK和SIRT1的蛋白表達量。結果顯
12、示:高脂喂養(yǎng)SIRT1的蛋白表達水平、AMPK-Thr172位點的磷酸化水平顯著降低,白藜蘆醇干預后能夠有效逆轉蛋白水平的降低。
5.白藜蘆醇抑制SREBP-1c基因表達
為了檢驗白藜蘆醇干預可能抑制NAFLD大鼠肝臟中過度活躍的SREBP-1c,我們檢測了SREBP-1c的蛋白表達,在NAFLD大鼠肝臟中SREBP-1c的積累被白藜蘆醇干預后顯著減少。在HF飲食下肝臟SREBP-1 c的mRNA水平被顯著增加,并且
13、這種作用完全被白藜蘆醇逆轉。這些結果表明,白藜蘆醇下調肝臟SREBP-1c表達,從而減少肝組織TG合成。
6.白藜蘆醇抑制SREBP-1c表達,抑制SREBP-1c的轉錄活性及其靶基因的表達
為了確定通過白藜蘆醇干預抑制SREBP-1c后的結果,通過Western印跡法,定量RT-PCR和ChIP實驗評估SREBP-1c在肝臟中的關鍵靶點FAS基因的表達。白藜蘆醇顯著抑制FAS的啟動子SRE與SREBP-1c的結合程
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