miRNA-21對大鼠糖尿病腎病TGF-β-Smad信號通路的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討miRNA-21對大鼠糖尿病腎病TGF-β/Smad信號通路的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　方法：
　　一.體外細(xì)胞實驗
　　1.通過實時熒光定量PCR檢測高糖和低糖條件下培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞miRNA-21表達(dá)的差異。
　　2.用生物信息學(xué)方法，預(yù)測、篩選miRNA-21作用的靶基因，并分別構(gòu)建野生型和突變型Smad7表達(dá)質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用雙熒光素酶報告基因驗證其靶基因。
　　3.構(gòu)建miR

2、NA-21過表達(dá)慢病毒，分別轉(zhuǎn)染高低糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白情況;用流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染率;用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miRNA-21的表達(dá)量;用MTT法檢測腎小管上皮細(xì)胞增殖情況;用Western blot檢測TGF-β/Smad信號通路Smad7的表達(dá)情況。
　　二.動物實驗
　　1.用三聯(lián)法（先切除大鼠左腎后，用高糖、高脂飲食誘導(dǎo)2月，再小劑量腹腔注射STZ）構(gòu)建SD大鼠糖尿病腎病模

3、型。
　　2.SD大鼠分為DN組、miRNA-21過表達(dá)慢病毒組、空載病毒組、正常飲食組。連續(xù)3次空腹血糖≥7.0 mmol/L，24h尿蛋白＞140mg/L視為建模成功。
　　3.通過尾靜脈注射miRNA-21過表達(dá)慢病毒及空病毒。
　　4.1月后處死大鼠，取血查尿素氮。
　　5.用實時熒光定量PCR檢測miRNA-21在腎組織中的表達(dá)。
　　6.用HE染色、PAS染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變;用透射電鏡觀察腎

4、臟超微結(jié)構(gòu)變化。
　　7.用免疫組織化學(xué)法檢測Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表達(dá)。
　　8.用Western blot檢測腎組織中Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表達(dá)并行比較。
　　結(jié)果：
　　一，體外細(xì)胞實驗
　　1.與低糖對照組相比，miRNA-21在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)降低(p＜0.05)。
　　2.根據(jù)生物信息學(xué)分析，Smad7可能是miRNA-21作用的靶基因，此

5、預(yù)測在雙熒光素酶報告基因中得到證實。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:miRNA-21過表達(dá)慢病毒體外轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率均在60％以上。
　　4.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒后，miRNA-21的表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05)。
　　5.MTT法結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染miRNA-21過表達(dá)慢病毒的腎小管上皮細(xì)胞中，高、低糖細(xì)胞轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力低于高糖細(xì)胞組及空病毒對照組(p＜

6、0.05)。
　　6.Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miRNA-21過表達(dá)慢病毒后Smad7蛋白的表達(dá)低于高糖空病毒組、低糖組和高糖組(p＜0.05)。
　　二.動物實驗結(jié)果
　?。ㄒ唬?、糖尿病腎病模型成功
　　1.空腹血糖:正常組空腹血糖平均值為4.637mmol/L，均＜7mmol/L。
　　3組實驗組空腹血糖平均值為13.04 mmol/L，均≥7.0mmol/L。
　　2.腎功能情況<

7、br>　　2.124小時尿蛋白
　　正常組24小時尿蛋白平均值為118 mg/L，均＜140 mg/L。
　　3組實驗組24小時尿蛋白平均值為313 mg/L，均＞140mg/L。
　　2.2尿素氮
　　正常組:尿毒氮平均值為6.2 mmol/L，均＜8.2 mmol/L。
　　3組實驗組:尿毒氮平均值12.1 mmol/L，均＞8.2 mmol/L。
　?。ǘ?、qPCR結(jié)果顯示:注入過表達(dá)慢病毒后

8、腎臟組織的miRNA-21的表達(dá)比空病毒組和DN組升高，差異有顯著性(P＜0.05)。
　?。ㄈ?、形態(tài)學(xué)改變
　　1.HE染色結(jié)果
　　正常組:腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增生，基底膜無增厚，腎小球大小正常，腎小管未見病變。
　　DN組:腎小球腫脹、系膜基質(zhì)增生，伴少量系膜細(xì)胞增生，腎小管上皮腫脹。
　　miRNA-21慢病毒組:腎小球系膜細(xì)胞增生不明顯，少量系膜基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞空泡變

9、性。
　　空病毒組腎組織病變類似于DN組。
　　2.PAS染色結(jié)果
　　正常組:未見系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增生，基底膜無增厚，腎小球大小正常，腎小管未見病變。
　　DN組:腎小球腫脹、伴少量系膜細(xì)胞增生，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，系膜基質(zhì)增生。
　　miRNA-21慢病毒組:腎小球系膜細(xì)胞增生不明顯，少量系膜基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性
　　空病毒組腎組織病變與DN組相似。
　　3.投射電鏡結(jié)果

10、>　　正常組:腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球形態(tài)完好，基底膜、足突結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞正常。
　　DN組:足突融合，基底膜增厚，溶酶體數(shù)量增多。
　　miRNA-21慢病毒組:系膜細(xì)胞泡沫化，增生，局部基底膜增厚，溶酶體數(shù)量增多，足突融合，腎小管正常，無免疫復(fù)合物沉積。
　　空病毒組:可見足突融合，基底膜增厚，近端小管溶酶體增多，遠(yuǎn)端小管:微絨毛少。
　?。ㄋ模?、免疫組織化學(xué)法結(jié)果:
　　Smad7在正常組的

11、胞漿呈弱陽性反應(yīng);在DN組及空病毒組，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，胞漿可見到深棕褐色著色;在miRNA-21慢病毒組呈弱陽性反應(yīng)，胞漿棕黃色著色明顯減少(P＜0.05)。
　　Smad2、Smad3在正常組的胞漿均呈陰性反應(yīng);在DN組及空病毒組，呈弱陽性反應(yīng)，胞漿可見到棕黃色著色;在miRNA-21慢病毒組呈陰性反應(yīng)，胞漿未見棕黃色著色(P＜0.05)。
　?。ㄎ澹?、Western blot結(jié)果顯示:腎組織的Smad7、Smad2、Sma