FHL3基因調(diào)控肌肉生長和肌纖維類型轉(zhuǎn)化的功能研究.pdf

1、FHL3(Four and a halfLIM domain protein3)屬于LIM蛋白質(zhì)超家族，主要在骨骼肌中表達，能夠通過LIM結(jié)構(gòu)域與肌分化因子MyoD、肌動蛋白、細胞周期調(diào)節(jié)因子等多種蛋白的互作，調(diào)控成肌細胞分化、細胞骨架結(jié)構(gòu)、肌細胞的形成以及下游基因的表達。本研究利用實驗室前期建立的轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠模型，研究了過表達FHL3基因?qū)±w維類型轉(zhuǎn)化和肌肉生長的作用，具體研究結(jié)果如下:
　　1.對實驗室前期獲得的F1代

2、轉(zhuǎn)基因小鼠進行了鑒定，完成了3個家系的轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的建系工作，擴繁至第5代。轉(zhuǎn)基因小鼠的后代性別比例均衡，陽性率隨傳代增加逐步升高，至第5代達到90％以上，外源基因能夠穩(wěn)定遺傳。同時，轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)仔能力，與野生型小鼠無顯著差異。利用實時定量PCR和Western Blot技術，分析2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟、肝臟、腎臟、肌肉和睪丸組織中FHL3基因的表達變化，結(jié)果表明FHL3基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉組織中特異性高表達。
　　2.

3、對轉(zhuǎn)基因鼠的體重增長進行檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因鼠的初生重與野生型小鼠無顯著差異，出生后1～8周的生長速度和肌肉比例極顯著高于野生鼠。HE染色和免疫熒光結(jié)果顯示股四頭肌、脛骨前肌、腓腸肌的肌纖維數(shù)目增多，橫截面積增大、密度減小。ATP酶染色和免疫組化的結(jié)果表明腓腸肌中Ⅱ型快肌纖維增多，Ⅰ型慢肌纖維減少。對轉(zhuǎn)基因小鼠進行力學測試，結(jié)果顯示其肌肉拉力增強，耐疲勞能力下降。轉(zhuǎn)基因小鼠心臟大小和重量與野生鼠無異，HE染色顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠心肌發(fā)育正常

4、，心肌尺寸與野生鼠無明顯差異，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中FHL3基因的mRNA水平顯著上調(diào)表達，但蛋白水平無顯著變化。
　　3.對轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌中FHL3和肌纖維類型相關基因進行了轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的分析。結(jié)果顯示:在mRNA水平，1、2和3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌中FHL3基因極顯著上調(diào)表達，Ⅰ型肌纖維相關基因MyHCⅠ/slow的表達極顯著下調(diào)，Ⅱ型肌纖維相關基因MyHCⅡa、Ⅱb、Ⅱx顯著上調(diào)表達。在蛋白水平，2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠腓

5、腸肌中FHL3、MyHC、MyHCⅡa和Ⅱb蛋白極顯著上調(diào)表達，MyHCⅠ/slow和Myoglobin顯著下調(diào)表達。同時對線粒體功能相關基因PGC1-α、COX2、COX4、AMPK和CS，糖酵解相關基因PDK4，介導蛋白質(zhì)降解的泛素連接酶Atrogin-1，Murf1和Musa1以及肌肉生長發(fā)育相關基因My f5、My f6、MSTN、MEF2c的表達變化進行檢測，PGC1-α、COX4、PDK4、Myf5、Myf6、MEF2c的表

6、達顯著上調(diào)，MSTN極顯著下調(diào)表達。這些結(jié)果證明了轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維類型的轉(zhuǎn)化，線粒體功能增強，能量轉(zhuǎn)化和利用率提高。
　　4.分離鑒定了轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞，通過實時定量PCR、Western Blot、流式細胞術和RTCAxCELLigence系統(tǒng)對肌衛(wèi)星細胞的增殖能力進行了分析，結(jié)果表明過表達FHL3基因促進肌衛(wèi)星細胞增殖，促進轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維數(shù)目和肌肉量增多。
　　綜上所述，本研究在活體水平上驗證了FH