家蠶含保幼激素結合蛋白結構域的BmJHBP基因家族鑒定及BmJHBPd2的功能研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是由古代野桑蠶經(jīng)長期馴化而成的泌絲昆蟲，在生物學領域是經(jīng)典的模式生物，在經(jīng)濟上具有極高的價值。由咽側體合成的保幼激素（Juvenile hormone，JH）與前胸腺合成的蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）是調(diào)控家蠶生長發(fā)育以及變態(tài)的兩種重要激素。其中，JH經(jīng)過咽側體合成并分泌至血淋巴中，與保幼激素結合蛋白（Juvenile hormone binding protein，JHBP）結

2、合并被運送到不同的靶器官，進而調(diào)控家蠶的生長發(fā)育。家蠶的經(jīng)濟效益與合成蠶絲蛋白的發(fā)達絲腺密不可分。早有研究報道，對家蠶添食JH能夠增加絲蛋白的產(chǎn)量，而家蠶JHBP（BmJHBP）作為JH信號通路傳導的第一個關鍵分子，與絲蛋白合成的關系是不清楚的。此前，學者已經(jīng)鑒定了家蠶部分的BmJHBP基因，發(fā)現(xiàn)在家蠶的多個組織器官內(nèi)均有表達，其主要表達在脂肪體和中腸。本研究旨在運用生物信息學全面鑒定并分析家蠶JHBP基因家族成員，采用RT-PCR、克

3、隆、Western blot、免疫熒光等技術手段對家蠶后部絲腺特異高量表達的BmJHBP基因的表達模式以及功能進行了分析和研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI，首先利用生物信息學對家蠶BmJHBP基因家族成員進行了鑒定。結果顯示，總共鑒定到了41個BmJHBP基因，分別分布在8條染色體上，主要位于第15和23號染色體?；蚪Y構分析發(fā)現(xiàn)，家族JHBP基因結構呈現(xiàn)出多樣化，在基因長度、外顯子等方面均有較大差

4、異。信號肽預測發(fā)現(xiàn)，33個 BmJHBP基因編碼一個信號肽，8個BmJHBP基因不編碼信號肽。經(jīng)過蛋白質(zhì)結構域分析，家蠶BmJHBP蛋白至少含有1個 JHBP結構域，且發(fā)現(xiàn)部分 BmJHBP蛋白同時包含 JHBP和Grp7_allergen結構域。將家蠶BmJHBP與小菜蛾PxJHBP、果蠅DmJHBP、蜜蜂AmJHBP等物種進化分析，結果表明JHBP基因家族可以分為兩枝、四個亞家族。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR實驗均表明，BmJHBP主要表

5、達于生殖腺、頭、表皮、中腸。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，BmJHBPd2是整個家蠶JHBP基因家族中唯一在后部絲腺高量表達基因。⑵利用生物信息學分析BmJHBPd2基因，結果表明該基因全長為8053bp，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，開放閱讀框（Open reading frame，ORF）長度為732bp，編碼243個氨基酸，前18個氨基酸編碼一個信號肽，剩下的氨基酸編碼一個典型的 JHBP結構域，等電點為4.80，預測分子量大小為27.3k

6、D，位于23號染色體的nscaf3027區(qū)域內(nèi)。在蛋白水平上，利用Western blot方法檢測BmJHBPd2蛋白在大造5齡第3天各組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)BmJHBPd2高量表達于后部絲腺，這與芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR結果一致。然后，通過RT-PCR分析BmJHBPd2在大造4齡第3天到蛹期的時期表達情況，發(fā)現(xiàn)BmJHBPd2在5齡1天到5天高量表達，在4齡眠期和5齡末期表達量較低。為了進一步驗證BmJHBPd2蛋白在細胞的表達部位，構

7、建了pSLfa1180-GFP-BmJHBPd2細胞過表達載體，轉染至BmE細胞，采用免疫熒光實驗，結果表明BmJHBPd2表達于BmE細胞的細胞質(zhì)中。利用石蠟切片和免疫熒光等方法，對BmJHBPd2在家蠶后部絲腺組織的表達部位作了定位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在后部絲腺的細胞質(zhì)層中高量表達，這與前面的RT-PCR、Western blot、亞細胞定位結果相一致。最后，qRT-PCR分析了BmJHBPd2在低產(chǎn)絲量品種大造和高絲量品種872的表達

8、量差異，結構表明在5齡第3天和5齡第5天，BmJHBPd2在872的表達量明顯高于大造，暗示這可能與絲蛋白合成有關系。通過GC-MS技術對家蠶5齡第3天后部絲腺的JH做了定性檢測，質(zhì)譜結果表明，與標準品相比，在后部絲腺的同一時間檢測到JH峰，說明家蠶在5齡第3天的后部絲腺具有JH。⑶選取大造5齡第1天家蠶，沿背中線涂抹1ug的JHA。結果表明，經(jīng)JHA涂抹的家蠶，其上蔟及化蛹時間均出現(xiàn)延遲1～2天。另外，涂抹JHA之后，家蠶的經(jīng)濟性狀均

9、明顯提高。選取涂抹JHA后的12h、24h、48、72h家蠶，經(jīng)過 qRT-PCR檢測 BmJHBPd2的表達水平，發(fā)現(xiàn)家蠶在涂抹 JHA后的BmJHBPd2的表達量呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢，說明外源JHA能夠促進BmJHBPd2的表達。為了進一步研究BmJHBPd2的功能，構建了pSLfa1180-BmJHBPd2細胞過表達載體，轉染至BmE細胞，qRT-PCR實驗表明向培養(yǎng)基添加JHA之后，JH信號通路上的早期因子Kr-h1顯著上調(diào)表達，說明