西瓜果實類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的克隆、表達與遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、類胡蘿卜素為以多個共軛的碳碳雙鍵為生色系骨架的脂肪族或脂環(huán)族類型化合物，是由植物和微生物合成的一大類色素，因具有多種醫(yī)學生物學功能而廣受關(guān)注。西瓜（Citrullus lanatus）屬于大眾化水果之一，瓜瓤所具有的紅、粉紅、黃、白等瓤色是由類胡蘿卜素組成與含量的差異所致的，研究西瓜類胡蘿卜素生物合成積累代謝，并進行遺傳操作，探討其抗腫瘤作用，可為西瓜類胡蘿卜素的開發(fā)利用，進行西瓜營養(yǎng)育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。
　　本課題從基因水平

2、上分析西瓜果實類胡蘿卜素合成代謝的調(diào)控機制，并建立農(nóng)桿菌介導的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，試圖通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對西瓜果實類胡蘿卜素的成分進行改良。此外，本課題還對番茄紅素和β-胡蘿卜素抗腫瘤作用的分子機制進行研究。主要內(nèi)容如下：
　　利用 RT-PCR和 RACE技術(shù)從西瓜果實中分離獲得牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氫番茄紅素合成酶基因PSY的cDNA全長序列，并通過生物信息學方法對其核酸及推導的氨基酸序列進行分析。結(jié)果顯示，（

3、1）西瓜GGPS基因cDNA序列全長1,445 bp（GenBank登錄號：KF914758），開放閱讀框為1,092 bp，編碼363個氨基酸，預測蛋白分子量約39 kDa。西瓜GGPS氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和黃瓜GGPS的同源性高達96％和95%。預測GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運肽信號序列。（2）西瓜PSY基因 cDNA序列全長1,561 bp（GenBank登錄號：KC166870），開放閱讀框為1,26

4、6 bp，編碼421個氨基酸，預測蛋白分子量約47.3 kDa。西瓜PSY氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分別高達95%和94%。預測PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運肽信號序列，轉(zhuǎn)運肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸為一跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。
　　種植四種不同瓤色的西瓜：紅瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黃瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”，采摘收集各發(fā)育和成熟時期（授粉后6天、12天、18

5、天、24天、30天、36天）的果實樣品，利用HPLC法檢測類胡蘿卜素的組成和含量，通過RT-qPCR技術(shù)分析類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶基因（GGPS，PSY，PSY-A，PDS， ZDS，CRTISO，LCYB，CHYB，ZEP，NCED1，NCED2和 NCED3）的表達。結(jié)果顯示，紅瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成熟果實中主要含番茄紅素，以及少量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、δ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素和紫黃質(zhì)。其中，番茄紅素在1

6、2 DAP時出現(xiàn)，在此后的發(fā)育時期，其含量逐漸增加并成為主要的類胡蘿卜素。在18-30 DAP期間，“CN66”中大多數(shù)類胡蘿卜素合成酶基因（包括GGPS）的表達量大幅增高，而代謝酶基因NCED1和NCED2的表達量較低，導致該時期類胡蘿卜素的大量積累；黃瓤“ZXG381”中主要含葉黃素和紫黃質(zhì)，并且在果實發(fā)育和成熟過程中，其二者含量分別與CHYB和ZEP基因的表達量呈正相關(guān)；在白瓤“ZXG507”果實發(fā)育過程中，始終只能檢測到痕量的葉

7、黃素和紫黃質(zhì)，主要歸因于類胡蘿卜素合成酶基因（尤其GGPS）的表達量較低，而代謝酶基因NCED1則保持較高的表達量。該結(jié)果表明，類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對不同瓤色西瓜果實中類胡蘿卜素的組成和含量具有十分重要的影響。
　　分別構(gòu)建由西瓜果實特異性AGPL1啟動子驅(qū)動類胡蘿卜素合成相關(guān)酶基因（GGPS，PSY，LCYB）的植物表達載體，并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。建立西瓜品種“紅一號”的子葉體外再生體系和農(nóng)桿菌介導

8、的遺傳轉(zhuǎn)化體系，試圖將GGPS基因轉(zhuǎn)化西瓜。結(jié)果顯示，（1）以3 d齡的無菌苗子葉為外植體，接種至不定芽誘導培養(yǎng)基MS+6-BA1 mg/L+IAA0.2 mg/L中，獲得的誘導率最高；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L。（2）不定芽誘導階段的卡那霉素篩選濃度為75 mg/L，生根階段的篩選濃度為40 mg/L。氨芐青霉素濃度為200 mg/L或頭孢霉素濃度為300 mg/L時，對外植體的生長無明

9、顯影響，可用于農(nóng)桿菌侵染后的脫菌和抑菌過程。外植體經(jīng)預培養(yǎng)2 d，用 OD600值0.5的農(nóng)桿菌EHA105（轉(zhuǎn)入植物表達載體pAGPL1-GGPS）菌液浸染10 min，再共培養(yǎng)3 d，有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率。經(jīng)PCR檢測，初步證實GGPS基因已經(jīng)導入西瓜植株，轉(zhuǎn)化頻率為1.33‰。
　　利用MTT法檢測番茄紅素和β-胡蘿卜素對人食管鱗癌細胞EC109增殖的影響，通過Western Blotting技術(shù)分析上述類胡蘿卜素對PP

10、AR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，番茄紅素和β-胡蘿卜素（5-40μM）均能顯著抑制 EC109細胞增殖，其抑制程度與處理濃度和時間呈正相關(guān)，即呈劑量-時間依賴效應；使用3μM GW9662（PPAR?特異性抑制劑）預處理，能夠部分減弱上述類胡蘿卜素對細胞的抑制作用；番茄紅素和β-胡蘿卜素（40μM）均能顯著促進PPAR?和p21WAF1/CIP1表達，抑制Cyclin D1和C