減毒傷寒沙門氏菌作為表面展示疫苗載體的應用研究.pdf

1、重組活菌載體疫苗是將外源抗原基因插入活菌載體的染色體或質粒中,激發(fā)免疫系統(tǒng)提呈該外源抗原并產生有效免疫保護,進而達到預防一種或多種疾病的目的。減毒沙門氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)因具有特殊的優(yōu)點而成為疫苗研究的熱點,被廣泛應用于病毒和細菌等疫苗的研制,并且顯示出良好的應用前景。在小鼠模型實驗中證明,使用減毒沙門氏菌株攜帶幽門螺旋桿菌保護性抗原尿素酶,可以有效將抗原提呈給免疫系

2、統(tǒng)。在減毒傷寒沙門氏菌研究方面已經(jīng)取得了相當大的進展,它既可以作為一個更有效的傷寒沙門氏菌疫苗,又可以表達異源抗原。其中最廣泛評估的減毒傷寒沙門菌疫苗候選株是CVD908(Ty2 aroC aroD)以及CVD908-htrA(Ty2 aroC aroD htrA)。
　　 一,利用λRed體內重組系統(tǒng),以CVD908為出發(fā)菌株,敲除其染色體上的asd基因,以期構建質粒-宿主平衡致死系統(tǒng),以便穩(wěn)定地表達外源抗原。用其基因組為模板

3、,擴增得到asd基因的上下游同源臂,通過酶切連接等方法,將上下游同源臂連接在打靶載體的卡那霉素抗性基因的兩側,以該載體為模板擴增得到高濃度線性打靶片段。將含λRed體內重組系統(tǒng)的質粒pKD46電擊轉化入CVD908,誘導重組系統(tǒng)表達后,再將打靶片段轉化進去,用含卡那霉素平板篩選出陽性轉化子。使用質粒pCP20去除卡納霉素抗性基因,從而得到CVD908的asd基因敲除株。
　　 使用與敲除asd基因相同的方法,在CVD908(Ty

4、2 aroC aroD asd)基礎上敲除了其毒力基因htrA,對其進行進一步的減毒,并通過PCR和RT-PCR等方法分別在DNA水平和RNA水平進行了上述基因敲除的驗證。
　　 二,在平衡致死系統(tǒng)的基礎上,構建表面展示載體,并對展示效果進行評價。敲除CVD908的asd基因后,菌株出現(xiàn)營養(yǎng)缺陷表型,然后用大腸桿菌(Escherichiacoli)的asd基因進行互補。在原始質粒pBAD-Assdsbe的基礎上,用大腸桿菌的as

5、d基因替換質粒上的氯霉素抗性基因,構建平衡致死質粒。在質粒的阿拉伯糖啟動子后面插入表面展示工具及幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶(ureB)基因編碼區(qū)序列,從而得到表面展示載體。然后將該載體電擊轉化入減毒沙門氏菌CVD908-htrA(Ty2 aroC aroD asd htrA),得到活菌疫苗株CVD908-htrA-LOU。利用UreB的單抗對疫苗株進行流式細胞計數(shù)分析、全菌蛋白和外膜蛋白提取結合免疫印跡分

6、析以及間接免疫熒光觀察分析,都證實UreB蛋白成功展示于菌體表面。
　　 三,對得到的重組菌進行安全性評價。通過細菌侵染小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7和人宮頸癌上皮細胞Hela細胞,進行侵襲力以及24h胞內增殖力實驗,表明CVD908-htrA-LOU較CVD908和野生株Ty2的侵襲力和在胞內生存力顯著減弱。此外又進行了小鼠半數(shù)致死量的實驗,也表明CVD908-htrA對小鼠的LD50較野生株Ty2提高了三個數(shù)量級,較出發(fā)

7、株CVD908也提高了一個數(shù)量級,充分說明新構建的重組菌CVD908-htrA-LOU安全性較野生株Ty2和出發(fā)株CVD908有明顯提高。
　　 四,將表面展示尿素酶B亞單位的活菌疫苗直接口服免疫BalB/C小鼠,進行動物體內免疫效果的評價。共設四個免疫組,第一組為生理鹽水組；第二組為空載體組(CVD908-htrA—LO)；第三組為尿素酶表面展示組(CVD908-htrA-LOU)；第四組為尿素酶胞內表達組(CVD908-ht