腹瀉小鼠腸道CFTR基因的表達及離子轉(zhuǎn)運作用研究.pdf

1、CFTR是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）中的一員，是一種Cl-離子轉(zhuǎn)運通道，它提供了一種Cl-穿過細胞膜轉(zhuǎn)運的路徑，在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)Cl-跨膜轉(zhuǎn)運的速率，除了作為液體流動及離子濃縮的中心外，CFTR還能決定鹽分的跨上皮膜運輸，因此，CFTR在腹瀉的發(fā)生中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。
　　本課題首先構(gòu)建小鼠的滲透性腹瀉模型，選取腹瀉小鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織為研

2、究對象，對小鼠腸道組織中的CFTR進行表達分析、分布及定位檢測，通過構(gòu)建CFTR表達載體的體外細胞培養(yǎng)試驗，研究CFTR重組蛋白對與腹瀉相關(guān)離子的轉(zhuǎn)運作用，闡明CFTR蛋白與腹瀉之間的關(guān)系。
　　首先，采用甘露醇灌胃的方法構(gòu)建小鼠腹瀉模型，灌胃40min左右小鼠開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，精神萎靡，行動遲緩，糞便呈現(xiàn)稀軟狀態(tài)；小鼠的腹瀉癥狀隨著時間的延長呈現(xiàn)加重趨勢，糞便呈現(xiàn)水樣。將腹瀉3h、9h的小鼠斷頸處死，取其十二指腸、空腸、回腸及結(jié)

3、腸組織。對CFTR基因的NBD1、NBD2結(jié)構(gòu)域及NKCC1基因進行克隆，PCR及免疫組化結(jié)果均顯示上述三種基因在正常組、腹瀉3h組、腹瀉9h組的十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸組織均有表達。熒光定量結(jié)果顯示三種基因在不同腸組織中的表達量存在差異，這可能是由于高滲環(huán)境的存在使得該三種基因的表達發(fā)生變化。
　　其次以小鼠基因組DNA為模板合成CFTR-NBD1、CFTR-NBD2基因的簡并引物，進行小鼠CFTR蛋白核苷酸結(jié)構(gòu)域的擴增、克隆

4、、測序，分別得到690bp、666bp的基因片段，翻譯成氨基酸序列，大小分別為230aa、222aa，經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)所獲得的CFTR-NBD1和CFTR-NBD2氨基酸序列都存在ABC蛋白家族特征性序列，初步確定本次PCR所擴增出的核苷酸產(chǎn)物是小鼠ABC蛋白的一段ATP結(jié)合區(qū)序列。分別將CFTR-NBD1、CFTR-NBD2基因的重組克隆質(zhì)粒與真核表達質(zhì)粒 pEGFP-N1均用限制性內(nèi)切酶進行雙酶，切酶切產(chǎn)物用T4連接酶進行連接，

5、構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-CFTR-NBD1、pEGFP-N1-CFTR-NBD2，通過PCR擴增、雙酶切和測序鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建了小鼠CFTR-NBD1、CFTR-NBD2的真核表達載體。
　　最后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-CFTR-NBD1、pEGFP-N1-CFTR-NBD2導(dǎo)入小鼠IEC細胞內(nèi)，空白組的IEC細胞未做任何處理，對照組用空質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染小鼠IEC細胞，結(jié)果

6、在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染組和對照組有熒光出現(xiàn)，空白組未見熒光，表明目的基因CFTR-NBD在IEC細胞中成功表達。收集細胞培養(yǎng)液作為細胞外液，收集細胞并用細胞破碎儀制成細胞懸液作為細胞內(nèi)液，分別檢測細胞內(nèi)外液中Na+、K+、Cl-3種離子濃度，并進行顯著性分析，結(jié)果表明在CFTR-NBD蛋白的作用下，這3種離子被從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞外。因此，確定此次獲得的CFTR-NBD是小鼠CFTR蛋白的核苷酸結(jié)合區(qū)基因，且CFTR-NBD蛋白有離子轉(zhuǎn)

7、運功能。
　　綜上所述，本課題首次在滲透性腹瀉小鼠模型中探討CFTR-NBD、NKCC1基因的表達，構(gòu)建真核表達載體pEGFP-N1-CFTR-NBD，對小鼠IEC進行培養(yǎng)并將CFTR-NBD基因?qū)胄∈驣EC中，使其成功表達，通過檢測3種離子濃度，發(fā)現(xiàn)CFTR-NBD蛋白有轉(zhuǎn)運這3種離子的功能。小鼠CFTR-NBD基因的成功克隆和表達有望通過揭示小鼠CFTR轉(zhuǎn)運蛋白的功能及轉(zhuǎn)運機制以便找到治療腹瀉的藥物分子的靶位，最終達到用藥物