綠色熒光蛋白標記的豌豆根瘤菌的獲得與功能分析.pdf

1、共生固氮在生物固氮中占有十分重要的地位。其中，主要的固氮共生體是農業(yè)上一類重要作物一豆科植物。根瘤菌(rhizobium)是與豆科植物共生、形成根瘤并固定空氣中的氮素供植物營養(yǎng)的一類桿狀細菌，這種共生體系具有很強的固氮能力。多數豆科植物根上形成具有固氮能力的根瘤，這是根瘤菌與豆科植物分子相互作用的結果。 根瘤菌對宿主豆科植物的侵染有一定的專一性，有的根瘤菌宿主范圍窄，有的宿主范圍廣，根瘤菌進入豆科植物的主要方式是在根毛上形成侵入

2、線。在土壤中根瘤菌與豆科植物相互識別，附著在宿主根毛上，使根毛卷曲，卷曲的根毛將根瘤菌包裹，其細胞壁內陷和伸長，逐漸形成一條管狀的侵入線。侵入線不斷伸長，到達皮層細胞，產生分枝，侵入線內的根瘤菌不斷繁殖，并釋放到皮層細胞，使其不斷分裂，形成根瘤組織。根瘤菌在根瘤內分化成類菌體，并被宿主來源的膜(又稱類菌體周膜)包圍，類菌體將N2還原成NH3，分泌至根瘤細胞內，并合成酰胺類或酰尿類化合物，輸出根瘤，由根的傳導組織運輸至宿主地上部分供利用。

3、但是根瘤菌感染根毛并通過侵入線進入根瘤的確切機制仍不清楚，其中，采用具有熒光標記的根瘤菌進行相關研究，將使研究結果變得具有直觀性，能夠促進相關研究得以更深入地進行。 GFP己證明是研究活體系統(tǒng)中的多種生物學過程的有利工具。自Chalfie等(1994)首次在大腸桿菌中克隆表達了的GFP以后。GFP作為一種新型的報告基因迅速引起全世界學者的極大興趣。GFP作為一種新型的報告基因具有許多優(yōu)越性：首先它分子量較小，只編碼238個氨基酸

4、的多肽，對細胞沒有毒性，不干擾標記蛋白的功能和定位。另外，GFP能在異細胞內表達并自發(fā)產生熒光的蛋白，由于不需要輔助因子的參與，故可直接用于活體測定?？梢哉f，GFP是當前研究活體細胞中基因表達和蛋白質分布的最好手段之一，具有廣闊的應用前景。 本實驗從豌豆根瘤菌gDNA中克隆到用于同源重組的DNA片段，獲得了具有eGFP綠色熒光蛋白標記的工程豌豆根瘤菌，以期為今后開展根瘤菌與豆科植物根部或轉結瘤素基因非豆科植物根部的相互識別、與結

5、瘤素基因的互作、以及侵入線和根瘤形成等方面的研究奠定基礎。主要實驗結果如下： 1．從豌豆根瘤菌gDNA中克隆到用于同源重組的DNA片段。 進一步分析表明，RL—gDNA片段1的序列包含3個基因。結構表明，3個基因屬于同一個操縱子單元。其中，陽離子轉運蛋白基因的編碼區(qū)得到完整克隆，通過序列分析比對，RL—gDNA片段l堿基序列的相似性程度(score)是332位、序列一致性的百分比(identity)為97％、氨基酸性質相

6、似比(positives)為98％、比對時插入的空位比(gaps)為0％，選定該片段作為同源重組片段。 2．構建了帶有豌豆根瘤菌gDNA同源重組片段和eGFP基因的原核表達載體。 3．獲得了具有eGFP綠色熒光蛋白標記的工程豌豆根瘤菌成功構建了表達載體pVCT2123，并將其轉入豌豆根瘤菌，獲得了GFP標記的豌豆根瘤菌。 4．在豌豆上獲得了具有eGFP綠色熒光蛋白標記的工程豌豆根瘤菌的根瘤。 利用具有eG