海藻糖合酶生產菌株優(yōu)化及酶學性質分析.pdf

1、海藻糖是一種無還原性雙糖，分子式是C12H22O11?2H2O，廣泛分布于自然界中許多生物細胞中。海藻糖是一種生物應激代謝產物，在一些極端環(huán)境生長的古生菌、真菌，以及生長在不良環(huán)境中的動植物細胞中海藻糖含量較高。海藻糖在生物細胞中的作用是保護細胞抵抗不良環(huán)境的影響，并且可以作為細胞供能物質，其功能是保護細胞質膜，蛋白質、核酸等生物大分子空間結構和功能活性，維持細胞滲透壓和防止細胞內營養(yǎng)成分流失。由于海藻糖具有以上功能，可用于醫(yī)學生物制品

2、中起到保護劑的作用；同時海藻糖也可以用于增強農作物抗逆性，通過轉基因手段來培育耐鹽堿型農作物，培育抗凍果蔬等；同時，海藻糖不具有還原性，不會發(fā)生美拉德反應，可以作為穩(wěn)定的添加劑應用于食品工業(yè)。因此，對海藻糖進行研究具有重要意義。
　　工業(yè)上普遍采用酶法來生產海藻糖，該方法生產效率較高，并且無污染，節(jié)約能源，省時省力。酶法生產海藻糖的關鍵在于獲得活性較高的海藻糖合成酶，目前在微生物細胞中總共發(fā)現(xiàn)了7種海藻糖合成酶共5條合成途徑，分別

3、是海藻糖合酶途徑（TreS途徑）、TreYZ途徑、OtsAB途徑、TreT途徑和TreP途徑。從目前研究方向來看，主要集中于尋找含有海藻糖合成途徑的菌株并進行改良獲得海藻糖高產菌株，從中直接提取海藻糖或者海藻糖合酶，改良手段主要包括傳統(tǒng)誘變、以及基因工程改良，兩種方法都可以獲得高產突變株。
　　本研究以細胞內含有3條海藻糖合成途徑（TreS途徑、TreYZ途徑、OtsAB途徑）共5種酶（TreS,MTSase,MTHase,TPS

4、,TPP）的谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）作為出發(fā)菌株，采用傳統(tǒng)紫外-化學藥物誘變方法獲得海藻糖高產突變株，然后進行細胞內海藻糖合成酶的提取并對酶性質進行分析，再進行培養(yǎng)基以及發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化獲得最佳培養(yǎng)條件。經(jīng)過實驗改良以后的突變株在最佳優(yōu)化培養(yǎng)條件下的海藻糖合酶產出為621U/mL，較優(yōu)化之前提高了1.88倍，并且突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　?。?）經(jīng)過傳統(tǒng)誘變處理后所獲得突變株，

5、其海藻糖生產能力得到大幅度提高，達到1.28g/100g干重·h-1，出發(fā)野生型菌株生產能力為0.45g/100g干重·h-1。經(jīng)過傳代試驗結果表明，突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。主要實驗結果如下：
　?。?）通過對酶性質進行分析可以有效的利用合成酶來生產海藻糖，海藻糖合酶具有可逆的酶活性，對其催化反應條件進行正交試驗優(yōu)化，得到最佳反應條件，在最佳催化反應條件下，海藻糖合酶由麥芽糖向海藻糖的轉化率為81.1％。海藻糖合酶、MTSas

6、e、MTHase、TPS和TPP酶最適反應pH值分別為：7.0,7.5,6.5,6.5,7.5，酶最適pH范圍分別為：pH6.5-8.0,pH6.5-7.5,pH6.0-7.5,pH6.0-7.5,pH6.5-8.0。酶最適反應溫度分別為35℃,35℃,40℃,35℃,35℃，酶最適溫度范圍為：30-35℃,35-40℃,30-45℃,25-40℃,30-35℃。
　　（3）使用析因設計（FFD）—中心復合設計(CCD)對培養(yǎng)基組

7、分進行優(yōu)化，以期得到最大海藻糖合酶產出，首先通過析因設計得到對響應值有顯著影響的因素，然后進行CCD設計找到最佳培養(yǎng)基組分方案。得到最佳培養(yǎng)基組分為：麥芽糖22.00g/L，牛肉膏7.49g/L，NaCl13.36g/L，K2HPO411.33g/L，蛋白胨15.00g/L。通過單因素試驗得到最佳發(fā)酵條件為pH7.0，接種量為108個/mL，發(fā)酵溫度34℃，在培養(yǎng)種齡30h后提取海藻糖合酶，搖床轉速為200rpm，選擇裝液量70mL/2