牡蠣殼組織工程骨材料制備和Rab5在骨系分化中的實驗研究.pdf

1、骨缺損和骨不連，依然是現(xiàn)今創(chuàng)傷性骨折治療中，外科整形重建所面臨最棘手的問題之一，“自體移植”和“異體移植”理論上可以達到最佳的恢復效果，被認為是臨床“金標準”。但是上述治療方法由于內在限制和缺陷，無法達到臨床的廣泛使用。骨移植由于來源受限，并發(fā)癥繁多，骨免疫因素等，無法大量開展。組織工程是作為一門新興交叉學科，發(fā)展于20世紀80年代，定義如下:將工程學和的生命科學基本原理技術結合，在體外構建具有生物功能的人工取代物，用于修復組織缺損，替

2、代失去功能或衰竭的組織、器官的部分或全部功能。由此，大量的人工骨材料被開發(fā)出來，極佳的生物相容性和骨可替代性使得骨組織工程材料能在臨床廣泛使用。牡蠣殼等海洋生物貝殼類具有資源豐富，結構致密，強度與皮質骨相當，其納米顆粒的形成過程于正常骨形成有相似特點，其中碳酸鈣(CaCO3)成分是95.994％，是一種十分有潛力的骨替代材料。如果將牡蠣殼合成并加工制作成一種組織工程骨材料，將為臨床骨缺損修復提供一種嶄新的治療手段。
　　骨質疏松癥

3、是骨科一種常見的全身性骨病，以骨質量損害，骨量減少及骨強度變低，最終導致骨脆性增加，發(fā)生脆性骨折為特性。主要的臨床表現(xiàn):周身疼痛，身高降低、發(fā)生脆性骨折、駝背以及對呼吸系統(tǒng)影響。骨質疏松癥對現(xiàn)今醫(yī)療系統(tǒng)負擔巨大，在分子水平，骨質疏松癥伴隨著成骨功能下降和破骨水平升高。在老年人中，骨質疏松癥已經(jīng)成為一項主要的健康問題，確診之后的后續(xù)治療也是在不斷調整。對于骨質疏松癥中，關于骨轉化和病理機制，越來越多的研究在開展，同時也使得相應的精確靶點治

4、療成為可能。Rab5作為鳥苷酸-5-三磷酸鹽(GTP)結合蛋白家族中的一員，在早期的細胞運動內吞作用過程，核內體的細胞運輸和成熟過程中，都起到關鍵性的作用。在人類細胞中，Rab5有三種不同的亞型存在（RAB5A，Rab5B和Rab5C）三種亞型之間存在重疊的胞內定位和細胞內吞功能的重疊。Rab5的主要定位于早期的內涵體，調控細胞的融合，對接和微管運動。有活性的GTP結合形式下，下游效應器（APPL1和APPL2）被結合，這次結合是區(qū)別早

5、期內涵體和調控信號轉導-運輸貨物的重要標志。在本次研究中，探究了Rab5蛋白參與骨系分化和骨重建過程，并在成骨骨骼生長中起到關鍵作用。
　　作者博士期間從事骨組織工程材料和骨系成骨分化相關研究。已經(jīng)有多篇SCI論文發(fā)表。本課題分為四個部分:一、牡蠣殼組織工程骨材料制備和特性;二、牡蠣殼組織工程骨材料生物學研究;三、Rab5在骨系分化中的作用。四、Rab5敲降/過表達對骨系分化的影響。我們的研究表明，牡蠣殼復合硫酸鈣材料可以通過改良

6、乙醇鹽溶法成功制取，復合工程骨可彌補單純硫酸鈣骨誘導性缺乏的劣勢，早期就能形成碳化羥基磷灰石;復合材料生物相容性佳，促進細胞增殖和成骨基因的表達，股骨缺損修復實驗效果明顯;Rab5在隨著成骨分化過程表達上升，臨床骨質疏松癥標本證實了這一現(xiàn)象;Rab5過表達促進成骨系分化，而siRNA敲降后抑制了成骨系分化，小鼠顱蓋骨體內siRNA注射抑制實驗證實Rab5在成骨發(fā)育過程中起著關鍵作用。
　　第一部分:牡蠣殼組織工程骨制備和特性

7、>　　目的:本實驗目的是制備全新的生物組織工程骨材料—硫酸鈣/牡蠣殼(CS/OS)。探究本材料的微觀結構，自固化性能，物相構成，力學特性，體外降解性和體外生物活性。
　　方法:復合材料CS/OS的制備和初步性能檢測:使用乙醇鹽溶法制備組織工程骨材料—硫酸鈣/牡蠣殼。鹽溶法制備體系中包括:30％氯化鈣，0.25％的丁二酸，乙醇/水比為2∶3的水溶液。通過x射線衍射(XRD)檢測復合材料的物相信息，場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)觀察復

8、合材料的微觀結構。在加水自固化過程中，我們分別檢測各個樣品的自固化時間，并根據(jù)養(yǎng)護時間點，測試各組力學性能差異。將不同組分工程材料放入人體模擬液(SBF)，7天后，運用X射線衍射XRD檢測浸潤后材料物相，使用帶有射線能譜(EDX)功能的場發(fā)射掃描電鏡FE-SEM檢測物質形貌并進行元素分析。將工程材料制成高3mm直徑6mm的圓柱體(Φ6mm×3mm)，放置于人體模擬液SBF中水浴，統(tǒng)計每組材料浸泡前后損失的重量。同時通過檢測各個時間點pH

9、值和Ca2+的濃度，對材料降解周圍的微環(huán)境進行評估。
　　結果:實驗探究了材料的自固化性能，力學特性和體外降解速率。本實驗得到如下的結果:相比較純半水硫酸鈣骨水泥CS，復合工程材料硫酸鈣/牡蠣殼粉CS/OS自固化時間相對延長11-28分鐘。隨著養(yǎng)護時間的延長，CS/OS工程材料力學性能在初始凝固之后呈現(xiàn)上升趨勢，其中復合工程材料CS/OS12力學性能最佳。牡蠣殼的添加使純半水硫酸鈣CS具備了體外生物活性，在人體模擬液SBF浸泡7天

10、后，CS/OS材料表面產(chǎn)生了碳素類骨羥基磷灰石，此類羥基磷灰石是最適宜人體成骨的礦物質。另外，相比純半水硫酸鈣，復合材料CS/OS的體外降解速率下降，差異有統(tǒng)計學意義，對于解決臨床硫酸鈣使用過程中降解過快，具有一定的意義。
　　結論:本實驗使用乙醇鹽溶液法成功制取牡蠣殼-硫酸鈣CS/OS骨組織工程材料，制備得到的牡蠣殼工程材料相比純半水硫酸鈣具有更優(yōu)良的骨修復材料特性。表現(xiàn)在更佳的降解速率和生物活性獲得。為臨床骨修復材料制備提供了

11、一種新思路。
　　第二部分:牡蠣殼組織工程骨生物學研究
　　目的:通過使用材料的浸提液和細胞共培養(yǎng)，探究材料對體外細胞增殖和成骨分化的作用。通過股骨髁缺損模型，植入牡蠣殼組織工程骨，評價其骨修復能力。
　　方法: MG63細胞系進行體外相容性實驗。材料浸提液培養(yǎng)MG63細胞后，使用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)方法，檢測細胞的增殖情況并評估材料的體外相容性。并行堿性磷酸酶染色（ALP染色）和鈣結節(jié)染色（Von Kos

12、sa染色）。蛋白質印跡分析(WB)，在7，14天時同時檢測Ⅰ型膠原(COLⅠ)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)。采用原位股骨髁缺損實驗，來評估CS/OS復合材料的骨修復再生效果。
　　結果:細胞增殖實驗中，牡蠣殼工程材料CS/OS浸提液處理細胞組尚未發(fā)現(xiàn)相關的毒性作用，一定濃度內可促進細胞增殖。ALP染色和Von Kossa染色實驗，牡蠣殼工程材料組顯示陽性。兩個指標BMP-2和COLⅠ，通過蛋白質印跡分析WB實驗比較，牡蠣殼工

13、程材料組相比較單純硫酸鈣組蛋白明顯的上調，有統(tǒng)計學差異。qPCR發(fā)現(xiàn)成骨相關基因表達在牡蠣殼材料組明顯上調，如BMP-2，Runx2，Osx，and OCN。股骨髁修復實驗中，牡蠣殼工程材料組形成的新骨，骨小梁體積更規(guī)則致密，骨髓腔清晰完整。單純硫酸鈣組新骨骨小梁稀疏。
　　結論:牡蠣殼復合工程材料具有優(yōu)良的生物相容性，可誘導成骨分化，同時促進成骨相關蛋白BMP-2和COLⅠ的表達。體內骨修復實驗也證實了牡蠣殼工程材料良好的骨修復

14、能力。
　　第三部分:Rab5在骨系分化中的作用
　　目的:本研究目的旨在探究Rab5在骨質疏松中成骨分化的作用，應用臨床標本和成骨細胞分化模型，觀察Rab5表達情況以及成骨相關基因動態(tài)變化。
　　方法:收集臨床標本，不同階段的骨質疏松標本，進行免疫組織化學染色，檢測不同階段骨質疏松，Rab5的表達量變化和病情是否有相關性。建立成骨分化模型后，檢測成骨相關特異性基因，1型膠原COL1，骨橋蛋白OPN，骨鈣素OCN，成骨

15、相關轉錄因子Runx2和OSX。并行堿性磷酸酶染色，茜素紅染色和Vonkossa染色。用免疫熒光共聚焦顯微鏡和蛋白印跡Western Blot方法檢測不同時間點Rab5含量和成骨特異性蛋白變化。
　　結果:臨床骨質疏松病人標本的HE病理切片顯示不同的臨床骨松階段，根據(jù)病人臨床資料，骨密度測量值Bone Mineral Density(BMD)，觀察到骨小梁規(guī)則和致密程度不同，HE病理提示骨質疏松標本符合實驗要求。之后對臨床標本進行

16、免疫組織化學染色，Sp7即Osterix在骨質疏松病人中表達下降，另一方面，Rab5蛋白表達隨著骨質疏松嚴重程度下調。MC3T3成骨階段性染色ALP，Alizarin Red和Vonkossa證實成骨模型成功建立。在成骨分化1，3，7，10，14，17和21天時，1型膠原COL1，骨橋蛋白OPN，骨鈣素OCN，成骨相關轉錄因子Runx2和OSX隨著成骨分化進行上調，Rab5和其效應蛋白APPL1、APPL2也表現(xiàn)出上調趨勢。免疫熒光共聚

17、焦的結果也于上述一致。
　　結論: Rab5和骨質疏松癥存在相關性，Rab5和其效應蛋白APPL1，APPL2的上調在MC3T3成骨分化過程中起到關鍵作用。
　　第四部分:Rab5的敲降/過表達對骨系分化的影響
　　目的:通過siRNA敲降Rab5表達，觀察敲降之后對成骨分化的影響。構建Rab5過表達質粒，觀察過表達Rab5對成骨分化影響。小鼠顱蓋骨內注射siRNA，觀察Rab5抑制后對骨發(fā)育的影響。
　　方法:

18、設計siRNA，使用siRNA敲降Rab5蛋白，之后開始成骨分化，檢測成骨相關Marker的變化，1型膠原COL1，骨橋蛋白OPN，骨鈣素OCN，成骨相關轉錄因子Runx2和OSX。并在相應時間點進行堿性磷酸酶染色，茜素紅染色和Vonkossa染色。構建PXJ-40載體的Rab5過表達質粒。通過瞬轉導入質粒，觀察過表達Rab5蛋白之后，對成骨分化的影響。設計體內siRNA，繁殖C57小鼠，對剛出生幼鼠Day2，注射siRNA并在相應時間

19、點取材，使用MicroCT觀察小鼠顱蓋骨骨發(fā)育情況。并用鈣黃素進行組織學染色，闡明在體內Rab5被敲降之后對成骨過程和骨發(fā)育的影響。
　　結果:Rab5a、Rab5c在siRNA敲降實驗中下降明顯，敲降之后開始進行成骨分化，在4，7天時，一型膠原COL1和轉錄因子Runx2下調，同時磷酸化-AKT也出現(xiàn)下調。過表達Rab5a、Rab5c質粒，瞬轉并開始成骨分化，OSX成骨轉錄因子出現(xiàn)上調，一些其他的成骨指標也維持在較高水平。敲降R

20、ab5的下游效應蛋白APPL1、APPL2也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。7天的時候對Rab5過表達/敲降的細胞進行堿性磷酸酶染色，siRNA敲降Rab5a、5c之后ALP染色陰性細胞率明顯上升。21天進行的茜素紅染色和Vonkossa染色在Rab5過表達/敲降過程中均沒有出現(xiàn)明顯變化。小鼠顱蓋骨siRNA注射之后，鈣黃素染色結果顯示Rab5a，Rab5c抑制組，骨形成速率減慢。從MicroCT結果顯示，小鼠顱蓋骨骨縫明顯加大，部分區(qū)域可見大片顱蓋骨