豹蛙抗瘤酶及其融合蛋白的畢赤酵母表達、中試、分離純化與結構-活性相關性研究.pdf

1、豹蛙抗瘤酶(onconase，ONC)是一種新型抗癌藥物，對多種實體瘤有很強的殺傷作用，是首個進入抗腫瘤臨床試驗的核糖核酸酶，也是當前全球重點研究的100種新藥之一。目前臨床使用的ONC均為天然ONC，提取過程繁瑣，來源受限，無法大規(guī)模應用，利用生物工程技術制備重組ONC(recombinant ONC，rONC)已經取得一些進展，但獲得的rONC仍存在表達量低和活性不高等問題。
　　本論文首次將 HSA與 ONC進行融合表達，利

2、用重組人血清白蛋白(recombinant human serum albumin，rHSA)的高表達特性及酵母的密碼子偏好性，同時考慮到連接肽是否插入以及連接肽的不同長度可能影響融合蛋白的結構進而影響其功能，設計4種長度的連接肽，連接肽以Gly4Ser1為模體進行重復，重復數(shù)量分別為0、1、2和3，構建融合蛋白基因序列，簡稱HSA-M(0,1,2,3)-ONC。對ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC基因序列進行優(yōu)化（糖基化位點

3、突變、GC含量提高、偏好密碼子、信號肽等），構建5種基因的7種載體-宿主菌組合并進行了篩選，并對rONC及其融合蛋白的發(fā)酵、中試放大以及純化過程中亟需解決的關鍵技術進行了研究，獲得了高純度和高活性的rONC及其融合蛋白。主要內容包括：
　　(1) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的高效表達畢赤酵母工程菌的構建及篩選：優(yōu)化ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC基因序列，構建ONC及HSA-M(0,1,2,3)-

4、ONC畢赤酵母表達載體，分別轉入3種宿主菌（X-33、GS115和SMD1168），對得到的7種載體-宿主組合進行誘導表達，篩選得到rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC高表達菌株。結果表明，5種外源蛋白在pPICZα-A/X-33組合表達水平均高于pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-A/GS115，均顯著高于pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、pPICZα-A/SMD1168

5、組合。
　　(2) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的表達條件優(yōu)化：本研究對pH、誘導溫度、培養(yǎng)基以及甲醇濃度等條件進行了優(yōu)化，結果表明rONC在1 L搖瓶規(guī)模的最佳表達pH為5.5，最佳誘導溫度為23℃；在3 L規(guī)模條件下，最佳培養(yǎng)基為低鹽基礎培養(yǎng)基（lower basic salt medium，LBSM），最佳誘導甲醇濃度為0.25％，rONC誘導7 d時表達量最高（155.0mg/L）；在1 L搖瓶規(guī)模下，

6、rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的最佳pH依次為6.5、7.0、7.0和7.0，最佳誘導溫度均為23℃；在3 L發(fā)酵規(guī)模條件下，最佳培養(yǎng)基為LBSM，最佳誘導甲醇濃度為0.25%，誘導10 d時rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的表達量最高，分別為1.65、1.53、1.37和1.52 g/L。
　　(3) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中試放大：在3L規(guī)?；A上，對rONC及rHSA-M(0,1,2

7、,3)-ONC進行中試放大（10 L和50 L）。結果表明，rONC在10 L和50 L最佳表達條件下的表達量分別為180.0 mg/L和195.0 mg/L；rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在10 L最佳表達條件下的表達量分別為2.15、1.93、1.87、2.02 g/L，在50 L最佳表達條件下的表達量分別為2.26、2.13、1.94、2.12 g/L。
　　(4) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的

8、分離純化條件摸索及純化體系放大：以rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC50L規(guī)模的發(fā)酵液為研究對象，進行分離純化條件摸索。結果表明，經雙水相偶聯(lián)分子排阻層析，獲得了純度高于95%，收率高于90%的rONC；經雙水相偶聯(lián) DEAE離子交換層析，獲得了純度均高于95%，收率均高于70%的rHSA-M(0,1,2,3)-ONC。
　　(5) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的活性測定：主要對rONC及rHSA

9、-M(0,1,2,3)-ONC的體外生物學活性(酶學活性、細胞毒性、穩(wěn)定性)進行測定。首先利用酵母tRNA為反應底物和酶促反應動力學方法，測定了rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC的酶學活性，結果發(fā)現(xiàn)rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC對tRNA降解活性從高到低依次為rONC、rHSA-M3-ONC、rHSA-M2-ONC、rHSA-M1-ONC，而rHSA-M0-ONC在相同條件下未測得tRNA降解酶學活性；其次，利用

10、SRB法測定rONC及rHSA-M(1,2,3)-ONC對18種細胞系（人實體瘤細胞、鼠實體瘤細胞、非實體瘤細胞以及正常細胞）活性的影響，結果表明，rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC抑制腫瘤細胞系的增殖，且對不同細胞系增殖的抑制作用有差異。其中，rONC對18種細胞系均有明顯的抑制增殖作用，rHSA-M0-ONC對18種細胞系均無作用，rHSA-M(1,2)-ONC對18種細胞系中的部分細胞系（Hela、RH-35、B16、2

11、93T、WISH和NIH-3T3）具有抑制增殖作用，rHSA-M3-ONC能夠對18種細胞中絕大多數(shù)(除DU145、HT-29、K562、HL-60、MEL和CHO外的12種)細胞株產生抑制增殖(等摩爾量條件下IC50約為rONC的3倍)，同時rONC及rHSA-M(1,2,3)-ONC對實體瘤細胞株的作用也要高于非實體瘤細胞株。穩(wěn)定性試驗表明：相同條件下(pH、溫度和時間)，rONC及其融合蛋白的穩(wěn)定性強弱依次為：rONC>rHSA-

12、M(1,2)-ONC>rHSA-M3-ONC>rHSA-M0-ONC。
　　(6) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC藥代動力學測定：利用雙抗夾心法測定rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在大鼠體內的藥代動力學，結果表明rONC的半衰期約為0.88±0.07 h，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的半衰期依次為：13.16±0.31 h、14.24±0.24 h、14.86±0.12 h和1

13、4.58±0.35 h。
　　(7)結構-活性相關性分析：分析rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的一、二級結構，結合rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶學活性、細胞毒性、穩(wěn)定性與半衰期，分析其結構-活性相關性，結果表明rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶活性和細胞毒性與連接肽長度相關，其中，rONC的酶活性和細胞毒性最強，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶活性和細胞毒性與連接肽

14、長度呈正相關；而穩(wěn)定性和半衰期與連接肽長度無明確相關性。進一步分析rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC二級結構發(fā)現(xiàn)，隨著rHSA-M(0,1,2,3)-ONC中連接肽長度的增加，其ONC部分的二級結構越近似rONC的二級結構，但rHSA-M(0,1,2,3)-ONC中 ONC部分有6個區(qū)域(3-10、19-23、35-45、57-69、85-89和96-102位氨基酸)發(fā)生結構變化，推測此變化可能與rHSA-M(0,1,2,

15、3)-ONC活性降低有關。
　　結論：本文建立了rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中試規(guī)模畢赤酵母高效表達及純化生產工藝。其中，rONC在50 L規(guī)模下表達量達到195.0mg/L，較現(xiàn)有文獻(150.0mg/L)提高了30%，建立了相應規(guī)模的純化工藝，獲得了純度大于95%，收率高于90%且具有良好的生物學活性的rONC；rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在50 L規(guī)模的表達量均達到2 g/L(等摩爾條件下rO