基于多酚氧化酶靶酶結(jié)構(gòu)的新型抑制劑先導化合物的合理設計與篩選.pdf

1、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一種由核編碼的結(jié)構(gòu)復雜的含銅的氧化還原金屬酶，催化酚類物質(zhì)的氧化，一種以Cu2+為輔基的氧化還原酶。在自然界中廣泛存在于植物、人體、動物、微生物等各種生物體中。PPO是引起果蔬褐變的重要的酶之一，果蔬的褐變引起了很大的經(jīng)濟損失。因此，高效新型的PPO抑制劑的開發(fā)具有重要的意義。
　　伴隨著計算機輔助藥物設計、分子生物學和酶學等多領域的迅速發(fā)展，合理的藥物分子設計已成為新藥

2、研發(fā)的重要途徑。在本研究中，我們根據(jù)PPO結(jié)構(gòu)特點，綜合運用計算機輔助藥物設計、生物活性測定及有機合成等技術對其新型抑制劑先導化合物進行虛擬篩選與合理設計、化學合成、生物活性測定。具體研究內(nèi)容如下:
　　一、先導化合物的虛擬篩選方面:首先，由于藕的PPO目前晶體結(jié)構(gòu)未解析出來，我們采用甘薯PPO為模板，通過SWISS-MODEL同源模建得到藕的PPO蛋白的三維結(jié)構(gòu)。然后根據(jù)已知抑制劑與已報道的PPO酶結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合模式和作用機制為

3、模板，分析確定了Suflex-Dock和GOLD-Wizard兩種對接方法來進行基于藕中PPO靶酶結(jié)構(gòu)的虛擬篩選。根據(jù)配體小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合構(gòu)象及結(jié)合力，從7萬多個商業(yè)化的小分子數(shù)據(jù)庫中篩選出24個潛在活性的化合物，通過Specs公司購買這24個候選化合物，并進行下一步的生物活性測定研究。
　　二、生物活性測定方面:利用紫外吸收分光光度計，通過測定410nm處的吸光度值來測定PPO的生物活性。對篩選得到的24個候選化合物進行了酶

4、體水平的生物活性測定。實驗結(jié)果表明，18號化合物對PPO的活性抑制能力最強，其IC50值達到了0.14mg/mL，與已商品化的PPO抑制劑抗壞血酸的IC50值相當(抗壞血酸為0.12mg/mL)，且18號化合物對接構(gòu)象及作用機制與參照結(jié)構(gòu)（苯基硫脲）類似。因此，我們將18號化合物作為先導化合物應用于進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化設計研究。
　　三、先導化合物的優(yōu)化設計方面:根據(jù)PPO活性位點與抑制劑之間的作用機制，結(jié)合參照結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)特點，對

5、18號化合物的結(jié)構(gòu)進行合理的優(yōu)化設計，最終確定優(yōu)化后的目標結(jié)構(gòu)為.-N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲。采用一鍋法合成21個目標化合物，并進行了IR、1H NMR結(jié)構(gòu)表征。利用同樣的生物活性測定方法，對得到的目標化合物進行生物活性測定。實驗結(jié)果表明，A2的生物活性最高，其IC50值為0.015mg/mL，與先導化合物相比，抑制率增加了89.29％。
　　四、定量構(gòu)效關系方面:對合成的21個目標化合物的結(jié)構(gòu)與其PPO活性數(shù)據(jù)之間進行定量