殼寡糖對大腸桿菌細胞內(nèi)生物分子動態(tài)變化的影響.pdf

1、殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物,由2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖聚合構(gòu)成,生物學(xué)功能豐富,已有研究表明殼聚糖及其降解產(chǎn)物殼寡糖可以有效地抑制大腸桿菌的生長,且具有無毒、易降解、生物相容性等優(yōu)點,應(yīng)用前景廣闊。目前,關(guān)于殼聚糖及殼寡糖對微生物的抑制規(guī)律已有大量的研究報道,其中包括殼聚糖會破壞微生物的細胞膜的滲透性,會引起微生物胞內(nèi)活性氧的含量增加等,但關(guān)于其抑菌機理方面的認識不足。本論文采用生物化學(xué)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,開展了殼寡糖在

2、抑制大腸桿菌生長過程中引起的生物分子動態(tài)變化的研究,結(jié)果如下。
　　利用平板計數(shù)法測定殼寡糖處理對大腸桿菌生長的抑制效果,結(jié)果表明在0.5％殼寡糖的作用下,活菌數(shù)表現(xiàn)為先減少后增多,而1%殼寡糖的處理使活菌數(shù)逐漸減少,抑菌效果明顯。通過檢測胞內(nèi)堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶的外泄情況得出在0.5%和1%殼寡糖的作用下,大腸桿菌的菌體完整性遭到了一定程度的破壞。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測了大腸桿菌的凋亡情況:大腸桿菌在培養(yǎng)2h、4h

3、和6h的情況下,細胞凋亡程度逐漸增強,而壞死程度基本穩(wěn)定。綜合分析大腸桿菌凋亡實驗結(jié)果、活菌數(shù)結(jié)果及菌體完整性的實驗結(jié)果,表明大腸桿菌的生長在受到殼寡糖影響時表現(xiàn)為壞死程度相對穩(wěn)定而凋亡程度不斷增加,說明殼寡糖可能主要是通過誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生凋亡來發(fā)揮抑菌作用的。
　　大腸桿菌在0.5%和1%殼寡糖的處理下,胞內(nèi)活性氧濃度快速升高,隨后逐漸降低,1%殼寡糖處理組變化趨勢較0.5%殼寡糖處理組明顯,而且在相同的時間下1%殼寡糖處理組活

4、性氧的相對含量高于0.5%殼寡糖處理組。在氧化性損傷的測定中,在0.5%和1%殼寡糖的處理下,膜質(zhì)的氧化損傷,蛋白質(zhì)的氧化損傷嚴重,丙二醛含量、蛋白質(zhì)羰基化和硝基化含量明顯高于對照組,0.5%殼寡糖處理的大腸桿菌在0-4 h內(nèi)丙二醛含量、蛋白質(zhì)羰基化和硝基化含量逐漸增加,而在4-16 h其含量逐漸減少。1%殼寡糖處理的大腸桿菌隨著時間的延長膜質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷逐漸增強。而DNA氧化損傷,在0.5%和1%殼寡糖的處理下,8-羥基脫氧鳥苷的

5、含量在2h和4h與對照組有明顯差異外,在其他時間內(nèi)DNA氧化損傷作用不明顯。上述結(jié)果表明殼寡糖處理可能通過誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧濃度增加和積累進而導(dǎo)致生物分子的氧化損傷,影響大腸桿菌的生長。
　　利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測了殼寡糖處理后大腸桿菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的差異情況。大腸桿菌在0.5%和1%殼寡糖處理下培養(yǎng)4 h,提取的大腸桿菌總蛋白經(jīng)雙向電泳分離,綜合處理組與對照組蛋白點的差異與不同,共分離得到1150個蛋白點,對蛋白質(zhì)的2-D電泳圖譜進

6、行比對分析,選擇2倍差異變化的蛋白點作為分析對象,結(jié)合膠上蛋白點的實際情況對其中的42個蛋白點進行質(zhì)譜分析鑒定,成功鑒定出40個蛋白點,這些蛋白點屬于35種蛋白質(zhì),殼寡糖處理組與對照組相比有28個蛋白點表達量上調(diào),有10個蛋白點表達量下調(diào),有2個特殊點在0.5%殼寡糖處理組與1%殼寡糖處理組和對照組之間呈現(xiàn)不同。為了進一步了解差異表達蛋白的功能,鑒定得到的蛋白質(zhì)進行功能聚類分析,結(jié)果表明上述蛋白主要參與物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和氧化還原等。