功能性食品中多肽的分離分析方法研究.pdf

1、論文采用基于親和層析的多肽分離技術(shù)以及基于雙偏振光干涉測定技術(shù)，研究了多肽的質(zhì)譜識別方法、與纖維連接蛋白的結(jié)合特性及其過程動力學，建立功能性食品中多肽的分離分析方法，論文取得的主要研究結(jié)果如下:
　　利用親和層析從明膠中分離能與FN結(jié)合的多肽，利用HPLC-MS分析多肽序列，利用MALDI-TOFMS和DPI分析了膠原多肽分子量和羥基化修飾對FN結(jié)合的影響。研究出能與FN結(jié)合的多肽序列中均含有GPAG或GPPG，其為FN結(jié)合的核心

2、序列;且這些多肽的分子量主要集中在1000-2000Da，識別出膠原蛋白序列中與FN結(jié)合的區(qū)域。分離的多肽易被人體吸收，為研制新的膠原活性多肽提供了理論依據(jù)。通過DPI測定不同分子量范圍的膠原多肽在固定FN芯片上的吸附厚度和質(zhì)量，結(jié)果表明低于1kDa的膠原多肽很難與FN發(fā)生結(jié)合，而分子量在2-30kDa的膠原多肽更易與FN結(jié)合;在與FN結(jié)合時，膠原多肽需要適度的分子量大小暴露出更多的FN結(jié)合位點才更易發(fā)揮結(jié)合活性，分子量范圍是影響膠原多

3、肽與FN結(jié)合的重要因素。合成不含和含有羥基化修飾的兩種序列的四個膠原多肽，其中有羥基化修飾和無羥基化修飾的兩者等物質(zhì)的量混合，利用MALDI-TOFMS測定羥基化修飾對結(jié)合FN的影響，結(jié)果表明合成多肽均可與FN結(jié)合，但羥基化修飾的位置和數(shù)量影響多肽與FN結(jié)合的強度。
　　利用凝膠過濾色譜、氨基酸組成分析法以及液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合酶切技術(shù)分析龜甲膠和鹿角膠中多肽類物質(zhì)，初步建立了功能性食品中蛋白和多肽的色譜分析方法。氨基酸組成分析龜甲膠和鹿

4、角膠中氨基酸組成與Ⅰ型膠原的氨基酸組成相似，說明龜甲膠和鹿角膠中主要含有Ⅰ型膠原蛋白。凝膠過濾色譜簡單快速的分析了龜甲膠和鹿角膠在提取步驟中溶液組分的分子量范圍變化，結(jié)果表明用TCA能夠沉淀龜甲膠和鹿角膠溶液中幾乎全部的蛋白質(zhì)，而不會沉淀糖類物質(zhì)，且用胰蛋白酶酶解沉淀溶解液，酶解充分。用液質(zhì)聯(lián)用分析了龜甲膠和鹿角膠蛋白酶解產(chǎn)物，搜索所有膠原蛋白的數(shù)據(jù)庫，結(jié)果表明鹿角膠中的膠原多肽序列與其原料物種更相近的膠原多肽序列相似;龜甲膠中的膠原蛋

5、白與兩棲類動物的Ⅰ型膠原蛋白序列相似，且龜甲膠中檢測出與典型爬行類動物Ⅰ型膠原蛋白序列相似的多肽，充分說明相似物種的膠原蛋白序列相似，為龜甲膠和鹿角膠中進一步的蛋白質(zhì)序列研究以及相應(yīng)的有效成分研究提供了理論基礎(chǔ)。
　　將蛋白多肽分析方法用于研究富含糖蛋白的燕窩功能性食品，證明所建立的方法可用于功能性食品中糖蛋白多肽的分析。由于燕窩中存在蛋白質(zhì)糖基化程度不均一和相對分子質(zhì)量范圍不穩(wěn)定，以及由此導致的蛋白質(zhì)難以分離、分析和鑒別的問題，

6、本研究利用分步法提取燕窩中的蛋白質(zhì)組分，采用糖苷酶和蛋白酶對其酶解，并用生物質(zhì)譜技術(shù)對蛋白質(zhì)降解進行了分析，數(shù)據(jù)庫檢索分析其中的序列，證明了基于質(zhì)譜識別功能性食品中的多肽序列是一種有效的多肽分析方法。用考馬斯亮藍法測定了燕窩中的蛋白提取率為79.7％，同時結(jié)合凝膠過濾色譜分析燕窩提取液和經(jīng)過兩種酶酶解后溶液中的分子量變化，譜圖分析表明燕窩經(jīng)糖苷酶酶切下N-連接的糖鏈，進而用胰蛋白酶酶解充分。氨基酸組成分析燕窩中天冬氨酸（含天冬酰胺）、絲