人IgG親和肽配基的仿生設(shè)計(jì)和親和色譜研究.pdf

1、單克隆抗體在治療炎癥、腫瘤和傳染類疾病等方面應(yīng)用廣泛，其中免疫球蛋白G（IgG）是最重要的一類抗體，抗體的分離純化是整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵步驟。肽配基與其他種類配基相比，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高，不會(huì)引起免疫原反應(yīng)，與蛋白的作用條件溫和。在親和色譜的實(shí)際應(yīng)用中，設(shè)計(jì)和篩選合適的多肽配基至關(guān)重要。
　　本文建立了一種基于IgG-蛋白A（SpA）親和作用的肽配基仿生設(shè)計(jì)方法，其核心包括4部分：（1）利用MM/PBSA方法結(jié)合自由能分解和殘基作用對(duì)分

2、析，獲得SpA的6個(gè)關(guān)鍵殘基；（2）利用氨基酸定位法，構(gòu)建IgG的親和分子模型和肽配基分子庫(kù)；（3）建立多級(jí)分子模擬篩選方法，得到多種備選配基；（4）利用親和色譜和電泳分析，確定高親和性配基。目前已經(jīng)確定了3條八肽配基FYWHCLDE，F(xiàn)YCHWALE和FYCHTIDE能與IgG有很高的親和作用。肽配基與IgG的親和結(jié)合以靜電作用為主，解離常數(shù)為1.5-6.1μM，吸附容量達(dá)到100-170 mg/mL。利用肽配基親和色譜從人血清中一步

3、分離純化，得到的人IgG純度達(dá)85％-90%。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示結(jié)合發(fā)生在“一致性結(jié)合位點(diǎn)”。在相同配基密度下，肽配基對(duì)IgG吸附容量為 FYWHCLDE>FYCHWALE>FYCHTIDE。
　　FYWHCLDE是候選多肽庫(kù)中打分排名第一的配基，選取4個(gè)配基密度研究對(duì)IgG和對(duì)照蛋白BSA的靜態(tài)吸附。研究發(fā)現(xiàn)多肽介質(zhì)在23.9μmol/mL的配基密度下具有最大的IgG選擇性。血清中抗體的穿透實(shí)驗(yàn)表明hIgG的動(dòng)態(tài)吸附容量隨配基密

4、度增加而增大。在最適配基密度下多肽介質(zhì)能從血清和細(xì)胞培液中對(duì)抗體進(jìn)行一步純化，得到的抗體純度為95%，回收率為89%。
　　吸附平衡結(jié)果表明雙配基體系中多肽會(huì)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，因此雙配基介質(zhì)對(duì)hIgG的親和性比其單配基介質(zhì)要高。FYWHCLDE-FYCHTIDE混合介質(zhì)具有最高的親和性，其協(xié)同效應(yīng)隨總肽配基密度增加而增大，在多肽摩爾比FYWHCLDE:FYCHTIDE=2:1時(shí)對(duì)hIgG的親和性達(dá)到最大（Kd值0.69μM），表明協(xié)