重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(recombinantVibriovulnificushemolysin，rVvhA)對(duì)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)的細(xì)胞毒性作用。
　　 2、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(rVvhA)對(duì)人單核細(xì)胞白血病(THP-1)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響并了解其機(jī)制。
　　 3、為進(jìn)一步了解和明確創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(Vibriovulnificushemolysin，rVvhA)的

2、分子致病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、IPTG誘導(dǎo)含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達(dá)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白rVvhA，SDS-PAGE分析其表達(dá)產(chǎn)物。其中以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)用三步洗滌結(jié)合Ni2+親和層析法對(duì)rVvhA進(jìn)行純化，純化后采用復(fù)性液與分步透析相結(jié)合的方法復(fù)性蛋白質(zhì)?；钚詒VvhA冷凍干燥成粉末于-70℃保存。
　　 2、不同濃度活性rVvhA作用THP

3、-1，CCK-8法檢測(cè)rVvhA對(duì)THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合Fluo-3AM鈣離子熒光探針測(cè)定rVvhA作用THP-1細(xì)胞瞬間胞內(nèi)鈣離子濃度變化，并檢測(cè)細(xì)胞外鈣離子螯合劑(EGTA)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響；AnnexinV-FITC/PI標(biāo)記法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡及壞死的情況，并檢測(cè)EGTA和BAPTA/AM對(duì)THP

4、-1細(xì)胞凋亡及壞死的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白Mr約為54kDa，SDS-PAGE結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值相符，表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌后，再經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，其純度達(dá)93％左右。純化后樣品經(jīng)復(fù)性后證明具有溶血活性，溶血活性為0.2mg蛋白/HU。
　　 2、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rVvhA活

5、性蛋白能顯著降低THP-1細(xì)胞的存活率，并呈現(xiàn)劑量依賴性。0.7HU/mlrVvhA的抑制率是59.87％。rVvhA作用后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度瞬間明顯增加，細(xì)胞分別經(jīng)胞外鈣離子螯合劑(EGTA)和胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)處理后，BAPTA/AM處理組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度升高幅度較EGTA處理組明顯增高。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)0.3HU/ml和0.5HU/mlrVvhA可分別誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，凋亡率分別為(4.58

6、3±0.467)％和(9.400±2.374)％。0.7HU/mlrVvhA可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞發(fā)生明顯壞死。EGTA和BAPTA/AM不抑制rVvhA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 rVvhA對(duì)THP-1有細(xì)胞毒性作用，抑制細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性；rVvhA作用THP-1細(xì)胞后可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度瞬間明顯升高，且升高的鈣離子可能主要源于細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流；rVvhA可以誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，細(xì)胞外鈣