通過定點突變表征綠膿桿菌芳香硫酸酯酶.pdf

1、背景：作為單通道光度法雙酶同測（SDESA-ELISA）的候選標記酶-綠膿桿菌芳香基硫酸酯酶（PAAS）結(jié)構(gòu)已知，但存在比活較低與37℃熱穩(wěn)定性較差這些問題，難以滿足應(yīng)用的需要。因此，需要對此酶進行分子工程改造，目前，定點突變因其高效性更多應(yīng)用于實際操作中。
　　目的：定點突變輔助分析構(gòu)效關(guān)系，獲得高活性高穩(wěn)定性的芳香硫酸酯酶，作為SDESA-ELISA合適的標記酶。
　　方法：在活性中心周圍，針對催化區(qū)域進行定點突變，經(jīng)測

2、序確認后，目的片段與含6-His標簽的PET-24a載體結(jié)合，構(gòu)成重組質(zhì)粒；經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，培養(yǎng)誘導(dǎo)表達，菌體裂解，蛋白純化后；表征各突變體；根據(jù)出現(xiàn)的特殊現(xiàn)象進一步分析，再依據(jù)結(jié)果進行新一輪設(shè)計得到相應(yīng)的突變體并表征?；拘再|(zhì)表征：包括SDS-PAGE,PAGE比活，酶反應(yīng)動力學參數(shù)，最適pH,金屬離子影響等相關(guān)酶學性質(zhì)；反應(yīng)中失活現(xiàn)象探究：各突變體反應(yīng)動力學曲線對比，產(chǎn)物的抑制作用及反應(yīng)期此酶穩(wěn)定性，針對M72K進行磁珠吸附分離釋

3、放再反應(yīng)；MALDI-TOF及超高分辨質(zhì)譜直接檢測酶分子在反應(yīng)期是否發(fā)生修飾作用；對PAAS和各定點突變體的熱穩(wěn)定性進行監(jiān)測：考察其處于37℃和4℃的半衰期；針對特殊現(xiàn)象，以同條件下野生型進行同期對比，并進行紫外吸收，熒光發(fā)射，同步熒光光譜掃描；以 MALDI-TOF判斷是否發(fā)生修飾作用。針對PAAS換用不同類型的緩沖液儲存，考察37℃熱穩(wěn)定性差異。
　　結(jié)果：活性中心位置附近定點突變對此酶的各項性質(zhì)影響很大。與野生型PAAS相比

4、，最適pH，金屬離子影響等方面均出現(xiàn)顯著改變；其中 R55K（幾乎失活）,K375（針對底物專一性發(fā)生改變）,M72系列（動力學參數(shù)下降約2個數(shù)量級）的改變最為突出；PAAS及其大多數(shù)突變體作用于其天然底物對硝基苯硫酸鉀（PNS）時，均出現(xiàn)隨反應(yīng)時間延長，動力學曲線發(fā)生明顯彎曲的現(xiàn)象（反應(yīng)中失活現(xiàn)象），尤其是 M72系列突變體；經(jīng)MALDI-TOF及超高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示在反應(yīng)過程中可能此酶發(fā)生了硫酸化修飾作用。觀察到突變體M72K37℃

5、pH7.4儲存于不同緩沖液中均存在顯著的熱激活現(xiàn)象,（即在一定時間內(nèi)37℃pH7.4緩沖液中，M72K隨儲存時間延長，對PNS比活明顯增加，超過兩個數(shù)量級；）同步追蹤其吸收光譜與熒光光譜并與野生型 PAAS在相同條件下進行比較，出現(xiàn)了明顯改變；而PAAS37℃儲存于不同緩沖液中，熱穩(wěn)定性差異較大，處于10mM pH7.4硼酸硼砂時，半衰期得到明顯延長。
　　結(jié)論：通過定點突變后，PAAS各定點突變體酶學性質(zhì)發(fā)生巨大改變，甚至出現(xiàn)特