FB1Ci-ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、伏馬菌素（fumo nis ins）是一組主要由串珠鐮刀桿菌在產(chǎn)生的真菌毒素，其廣泛存在于糧食與飼料中，尤其是玉米、小麥及其一些農(nóng)副產(chǎn)品污染較為嚴(yán)重，對(duì)人畜的健康造成較大的威脅。目前，已發(fā)現(xiàn)有15種伏馬菌素，其中FB1、FB2和FB3是自然界中產(chǎn)生的主要毒素，而F B1被認(rèn)定是污染玉米及其制品的主要組分，也是伏馬菌素毒性產(chǎn)生的主要原因。
　　FB1具有神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性、肝腎毒性以及致癌性等，被國(guó)際癌癥研究中心（IARC

2、）劃分為2B類(lèi)致癌物。大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1與人類(lèi)食道癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，但未有直接證據(jù)證明。當(dāng)前，針對(duì)FB1的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELIS A）等。由于色譜法對(duì)儀器要求較高，費(fèi)用昂貴，且需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作，限制了儀器的推廣應(yīng)用，而ELIS A具有特異性高、靈敏度好，簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)得到了較為廣泛的應(yīng)用，受到眾多專(zhuān)家的青睞。本研究主要是在F

3、 B1完全抗原及其單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立一種Ci-ELISA方法，并進(jìn)行了玉米樣品的臨床檢測(cè)。
　　本試驗(yàn)首先采用了戊二醛一步法對(duì)半抗原F B1與載體蛋白O VA進(jìn)行偶聯(lián)，制備完全抗原，分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、紫外掃描法(UV)和質(zhì)譜法(MS)等對(duì)FB1與OVA的偶聯(lián)效果進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示偶聯(lián)成功。經(jīng)質(zhì)譜法檢測(cè)得F B1-OVA和OVA的相對(duì)分子量分別是51928.612和44265.718，計(jì)算FB1

4、與OVA的偶聯(lián)比為10.6:1。將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，注射入小鼠腹腔，收集腹水并進(jìn)行純化，獲得FB1單克隆抗體，經(jīng)過(guò)間接ELISA方法的檢測(cè)，可得單抗的效價(jià)為1:1×105，濃度為2.56 mg/mL,雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體亞型為IgG1，經(jīng)多次傳代與凍存后，仍可穩(wěn)定分泌抗體。
　　在FB1單克隆抗體基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，建立了Ci-ELIS A檢測(cè)方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-38.524x+98.816，相關(guān)系數(shù) R2=

5、0.9961，該方法測(cè)定線性范圍2.5~250 ng/mL，靈敏度（IC50）為12 ng/mL，最低檢出限為2.28 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為2.35％，批間變異系數(shù)為1.96%。檢測(cè)玉米加標(biāo)回收率，批內(nèi)回收率范圍102±4%–90.5±3.2%，批間回收率范圍96.3±7.6%–86.7±5%，平均批內(nèi)變異系數(shù)為3.84%，平均批間變異系數(shù)為6.22%。與FB2的交叉反應(yīng)率為60.4%，與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），黃曲霉毒素B

6、1（AFB1），赭曲霉毒素A（OTA）交叉反應(yīng)率均小于1%。
　　本試驗(yàn)運(yùn)用建立的FB1 Ci-ELISA方法對(duì)安徽省阜陽(yáng)市、亳州市、合肥市、蚌埠市、安慶市和淮北市等六個(gè)地區(qū)144份玉米樣品進(jìn)行了臨床檢測(cè)，結(jié)果顯示，蚌埠市F B1陽(yáng)性污染率最低，為20.8%，污染含量介于0.062-0.237μg/k g之間，平均污染水平為0.074μg/k g；阜陽(yáng)市FB1陽(yáng)性污染率最高，達(dá)到95.8%，污染含量在0.52-1.37μg/k g