豬流行性腹瀉病毒S蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、gngdaoAgriculturalUniversityProfessionalMasterDegreeThesisofVeterinaryMedicineConstructionandImmunogenicityResearchofRecombinantBaculovirusesExpressingSProteinofPorcineEpidemicDiarrhoeaVirusGraduatewithProfessionalMaster

2、DegreeTanLlanL1‘Mentor：ProfZhangLecuiSecondMentor：ProfFanGen-chengTypeofProfessionalDegree：MasterofVeterinaryMedicineQingdaoChinaJune，2014豬流行性腹瀉病毒S蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建及免疫原性研究摘要豬流行性腹瀉(Porcineepidemicdiarrhoea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcin

3、eepidemicdiarrhoeavirus，PEDV)是一種引起腹瀉，嘔吐，脫水的高度接觸性腸道傳染病，各年齡段的豬均易感染。近年來(lái)，該病的流行區(qū)域呈擴(kuò)大趨勢(shì)，影響世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，防控豬流行性腹瀉的方法依然是預(yù)防為主，接種疫苗是最為有效的方法之一。現(xiàn)在用于預(yù)防的疫苗主要是滅活苗、弱毒疫苗等常規(guī)疫苗，但在使用中存在一定隱患和缺陷，且疫苗成本較高，對(duì)于經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)條件下的養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)并不是理想的選擇。亞單位疫苗作為

4、基因工程苗的一種，擁有較好的安全性，價(jià)格較常規(guī)苗相對(duì)低廉，所以，對(duì)于豬流行性腹瀉病毒(PEDV)新型疫苗的研制是十分必要的。為探索研制一種更加高效、安全的新型豬流行性腹瀉疫苗為目的，本研究展開了以下試驗(yàn)。選用s基因全序列作為靶基因，因?yàn)镻EDVs蛋白是包被在病毒粒子表面的糖蛋白，在介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的過(guò)程中可發(fā)揮重要的作用。通過(guò)豬流行性腹瀉病-／l-PDl2株進(jìn)行R1’PCR擴(kuò)增獲得。將S蛋白基因克隆_EpMDl8T載體，提取質(zhì)粒經(jīng)E

5、coRI、SphI雙酶切，鑒定并測(cè)序。然后將質(zhì)粒與載體pFastBacl刪均進(jìn)行雙酶切，回收，連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至EcoliDHl0Bac，挑出單個(gè)白色菌落，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)柵CR鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒BacmidPEDV-S轉(zhuǎn)柒Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病-毒rAcPDl2S。將接種桿狀病毒的細(xì)胞碎片進(jìn)行1％磷鎢酸溶液負(fù)染，通過(guò)透射電鏡可觀察到典型的桿狀病毒特征形態(tài)的病毒顆粒。將重組桿狀病毒rAcPDl2S和非重組桿狀病毒AcM

6、NPV接種Sf9昆蟲細(xì)胞，對(duì)總蛋白進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示：AcMNPV泳道并沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，而rAcPDl2S泳道出現(xiàn)特異l生160kDa蛋白條帶。試驗(yàn)表明，rAc-PDl2S在Sf9昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)出豬流行性腹瀉病毒s蛋白。購(gòu)買PEDV抗原抗體均為陰性的3日齡仔豬20頭，隨機(jī)分為4組，每組5頭。第一組：rAc-PDl2S高劑量免疫組(rAcPDl2SH)劑量為lmL／頭(108TCID50／mL)；第二組rAc