?；摅w糖苷的生物合成及活性鑒定.pdf

1、天然產物的糖基化修飾在植物、動物和微生物中廣泛存在。通過對大分子生命物質和小分子非生命物質的糖基化及其后續(xù)的酰基化、甲基化等修飾來調節(jié)生物體的生命活動。生物體中糖基化過程主要由不同類型及功能的糖基轉移酶(GT)來完成，進一步，在酰基轉移酶的作用下對糖苷?；男揎棧瑫r產生出多種多樣具有重要藥用價值的天然產物。藥物的糖基化及后續(xù)的修飾具有提高藥物活性、提高生物利用度、降低毒副作用等重要作用。
　　甾體類物質普遍存在于生物體中，在植

2、物中主要以甾體糖苷和?；摅w糖苷形式存在。因甾體類型的不同、糖苷種類的變化以及糖基團所連?；N類及位置的不同而呈現出多種不同的形式。研究表明藥用植物桑多斯虎眼萬年青（Ornithogalum saundersiae）中含有多種乙?；摅w皂苷類物質，如具有顯著抗癌活性的“OSW-1”，但由于含量稀少、提取復雜、合成困難嚴重阻礙了其進一步研究。
　　本次研究從具有多種?；擒疹惢衔锏纳６嗨够⒀廴f年青（O.saundersiae）

3、中克隆得到19條糖基轉移酶相關基因，利用其中甾體糖基轉移酶(SGT)基因作為生物合成工具來催化甾體類物質得到甾體糖苷，并進一步發(fā)現了大腸桿菌中能夠催化甾體糖苷乙?；孽；D移酶(OGT)。以此設計乙?；摅w糖苷的生物合成方法，成功得到8種乙酰基單?；摅w糖苷并對其進行了藥理活性篩選，結果顯示與未?；セ┑溺摅w糖苷相比抗癌活性明顯增強。
　　1、糖基轉移酶基因的克隆及大腸桿菌異源表達
　　提取桑多斯虎眼萬年青總mRNA，反

4、轉錄得到cDNA。以轉錄組測序得到的序列信息設計引物，利用巢式PCR克隆得到19條糖基轉移酶基因(OsGT)。利用In-Fusion原理設計引物，成功構建了原核表達載體。通過與分子伴侶共表達的方式進行誘導表達，獲得了目的蛋白的可溶性表達。
　　2、糖基轉移酶的功能鑒定及酶學性質研究
　　糖基轉移酶的底物有糖基供體和受體兩種，二者可與糖基轉移酶形成三元復合體，進而進行相應的催化作用。通過將所得到的糖基轉移酶基因進行生物信息學分

5、析，進而確定主要的糖基供體和受體類型，分別利用49種不同類型的小分子天然產物作為糖基受體，選取UDP-Glc、UDP-Xyl、UDP-GlcA、UDP-Gal、UDP-GalA、UDP-Ara和UDP-GlcNAc7種糖基供體進行受體和供體寬泛性研究。并進一步通過HPLC、質譜和NMR對所得糖基化產物進行鑒定。通過對實驗結果進行分析，最終確定了OsSGT1為甾體特異的糖基轉移酶。此外，通過對OsSGT1酶學性質進行研究，發(fā)現其最適的反應

6、溫度為50℃，最適pH為9.0-11.0，并確定了重金屬離子的對其催化活性的影響。
　　3、甾體糖苷乙?；D移酶的發(fā)現與研究
　　在以大腸桿菌破碎液得到的糖基轉移酶粗酶進行底物糖基化修飾的反應中，我們意外的得到了對應的甾體糖苷乙?；a物。通過對大腸桿菌BL21(DE3)基因組進行分析得到了3條“O-乙?；D移酶基因(OAT)”序列，通過設計引物，最終從大腸桿菌BL21(DE3)中克隆得到了3條O-乙?；D移酶：EOAT1、E

7、OAT2和EOAT3。通過進行表達載體的構建、蛋白表達和功能鑒定，發(fā)現EOAT2具有催化甾體糖苷乙酰化的功能。此外，我們還通過酶學實驗對其酶學性質進行了研究。
　　4、乙酰化的甾體糖苷的生物合成及應用
　　以甾體類化合物睪酮和雌二醇為底物，利用OsSGT1進行糖基化反應形成相應的葡萄糖苷，即睪酮17β-O-β-D-葡萄糖苷和雌二醇17β-O-β-D-葡萄糖苷;然后，再通過乙?；D移酶(EOAT2)的催化作用，利用大腸桿菌內源

8、或者外源添加乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)形成睪酮17β-O-β-D-葡萄糖苷-O-乙酰和雌二醇17β-O-β-D-葡萄糖苷-O-乙酰，以此合成途徑合成了不同糖苷位點乙?；膯熙；a物，通過對這些乙酰化的甾體糖苷進行藥理活性篩選發(fā)現其具有增強了的抗人類肺癌細胞(NCI-H460)活性。
　　5、鯊烯合酶(OcSQS1)的研究
　　通過對虎眼萬年青（Ornithogalum caudatum）轉錄組測序、數據分析，得到了全

9、長1230bp的鯊烯合酶unigene，進一步通過ORF分析發(fā)現其編碼區(qū)為1044bp，命名為OcSQS1。將該基因進行生物信息學分析，發(fā)現OcSQS1為一種膜結合蛋白，其等電點是5.01，進化樹分析發(fā)現其屬于植物類SQS家族。為得到其原核可溶性表達并進一步確定其功能，進行了多種不同類型表達載體的構建，蛋白表達純化，通過western-blot驗證，進一步通過體外酶促反應后由HPLC、GC-MS檢測催化產物。最終以截去C-端膜結合區(qū)的突