miRNA在二化螟蛻皮激素合成通路中的調控功能分析.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)，屬鱗翅目，螟蛾科，在我國分布廣泛，是最重要的水稻害蟲之一，主要以鉆蛀莖桿為害。本論文克隆了9個二化螟20E合成通路基因的3'UTR，使用miRNA靶標預測軟件預測了二化螟miRNA在20E合成通路3'UTR上的靶標位點，通過體外雙熒光素酶報告基因實驗進行了靶標驗證，檢測了miRNA在二化螟5齡、6齡幼蟲及蛹期的逐日表達譜。根據表達譜，選定合適的miRNA mimics注射時間點

2、，觀察注射后的表型變化，測定了二化螟血淋巴20E含量，揭示了miRNA在二化螟變態(tài)發(fā)育中的功能。
　　1、二化螟20E合成通路基因3'UTR的克隆
　　使用RACE技術克隆了二化螟蛻皮激素合成通路中9個蛋白質編碼基因的3'UTR,包括csu-babo、csu-dib、csu-dsmad、csu-erk、csu-nvd、csu-ptth、csu-punt、csu-ras、csu-shd。9個基因3'UTR的平均長度為526 b

3、p，其中csu-ras基因3'UTR長度最長，為1043bp; csu-dib基因3'UTR長度僅為55bp。
　　2、二化螟miRNA在20E合成通路上的靶標預測
　　利用miranda、targetscan、RNAhybrid、microtar、PITA等5個軟件進行了miRNA的靶標預測，選擇了至少4個軟件預測為靶標的結果，篩選出可作用于csu-nvd基因的靶標為csu-miR-9b、csu-miR-239、csu-m

4、iR-241;可作用于csu-spook基因的csu-miR-bantam、csu-miR-024、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-124、csu-miR-154、csu-miR-257;可作用于csu-dib基因的csu-miR-260。預測結果顯示，csu-spook基因被多達7個miRNA基因調控，這3個潛在的miRNA靶標基因都為Halloween基因，參與了蛻皮激素20E的合成。
　　3、二化

5、螟20E基因與miRNA的體外靶標驗證
　　通過體外雙熒光素酶報告基因實驗，驗證了11個二化螟miRNA(csu-miR-8、csu-miR-9b、csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-124、csu-miR-154、csu-miR-241、csu-miR-257、csu-miR-260）與3個二化螟20E合成通路基因(csu-nvd、csu-dib、csu-spook)之間的靶

6、標關系。結果表明，csu-miR-9b與csu-miR-241能夠作用于csu-nvd基因，且csu-miR-9b的抑制作用更強，抑制率達50％; csu-miR-260作用于csu-dib基因的3'UTR，抑制率為25％;csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257均可作用于csu-spook基因，抑制率分別為，40％，20％，15％，45％，55％。但是，c

7、su-miR-124反而促進csu-spook基因的表達，顯示為熒光信號增強。
　　4、二化螟20E合成相關的miRNA在5齡、6齡幼蟲及蛹期的表達譜
　　利用定量PCR技術，檢測了7個miRNA，csu-miR-9b、csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257、csu-miR-260在二化螟5、6齡幼蟲與蛹的逐日表達譜，結果表明各miRNA的表達

8、量變化趨勢差異明顯。csu-miR-9b在5齡幼蟲中表達最高，在蛹期最低;csu-miR-bantam、csu-miR-80在6齡幼蟲中高表達，而csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257、csu-miR-260在蛹期高表達。
　　5、過表達二化螟20E合成相關的miRNA基因對化蛹的影響
　　根據各miRNA在6齡到蛹期轉換過程中的表達量，選取6齡第4天作為mimics注射的時間點。同時，根據mi

9、RNA的靶標，將注射分為三組:csu-miR-9b一組，靶標為csu-nvd基因;csu-miR-260一組，靶標為csu-dib基因;csu-miR-bantam、csu-miR-80、csu-miR-89、csu-miR-154、csu-miR-257一組，靶標為csu-spook基因。結果表明，三組mimics注射都導致了死亡率上升、化蛹率下降、化蛹延遲和血淋巴20E滴度下降。顯示這些miRNA分別作用于各自靶標基因，抑制二化螟2