纖溶酶基因的克隆及其在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達.pdf

1、本研究所用纖溶酶ZLW-2來源于保定市屠宰場土壤里篩選出的芽孢桿菌ZLW-2，具有強烈的溶解血栓的作用，可作為一種治療心腦血管疾病新型藥物予以開發(fā)。本文利用基因克隆技術，分離得到該酶的全長DNA序列，并提交GeneBank，登錄號為EU734749。序列分析表明，Bacillus sp.ZLW-2纖溶酶基因全長1146 bp，包含一個完整編碼閱讀框，編碼381個氨基酸，理論分子量為39.358KD。經(jīng)signalP3.0分析，在29個氨

2、基酸A前為信號肽序列(signal peptide)，后面是一段77個氨基酸殘基組成的前導肽(propeptide)和275個氨基酸殘基的成熟肽(mature peptide)。本序列在GeneBank中BLAST比對，結果發(fā)現(xiàn)，此酶核苷酸序列與日本發(fā)現(xiàn)的納豆激酶NK和納豆激酶AY210091同源性達99％，而且此酶具有和納豆激酶相同的活性中心Asp32，His64 and Ser221和底物結合中心Ser125，Leu64和 Gly1

3、27，屬于絲氨酸蛋白酶。因此可以初步認定此纖溶酶即為納豆激酶。
　　 根據(jù)已測序的纖溶酶EU734749基因序列及原核表達載體pET28a的性質，設計引物分別擴增包括信號肽，前導肽和成熟肽的前纖溶酶原(NK1)序列，包括前導肽和成熟肽的纖溶酶原(NK2)片段以及只包括成熟肽的纖溶酶(NK3)片段，并將其分別連接到表達載體pET28a轉化大腸桿菌BL21中進行誘導表達。結果表明，三種重組質粒均具有良好的遺傳穩(wěn)定性，傳代100代后重

4、組質粒仍穩(wěn)定存在。其中重組質粒pET28a-NK2和pET28a-NK3的工程菌株經(jīng)誘導后并沒有發(fā)現(xiàn)酶活，產物經(jīng)超聲波破碎和包涵體變性復性后依然沒有檢測到纖溶酶活。而含有前纖溶酶原基因NK1的工程菌在30℃，0.1mmol/L IPTG誘導20h后的表達產物經(jīng)-80℃反復凍融后酶活可達183U/mL。
　　 為了進一步提高外源基因的穩(wěn)定性及表達量，將纖溶酶原基因pro-nk，nk克隆到畢赤酵母中進行研究。根據(jù)所獲得的基因序列EU

5、734749和真核表達載體pPIC9K的性質重新設計引物，構建重組質粒pPIC9K-pro-nk，pPIC9K-nk。將重組質粒線性化后，電轉化畢赤酵母GS115，MD，MM快慢型和酶活透明圈初篩，通過檢測重組酵母發(fā)酵上清液中的纖溶酶活性復篩得到一株外源蛋白產量較高的重組酵母PK53。通過對PK53的生長規(guī)律和發(fā)酵條件的研究發(fā)現(xiàn)，外源基因的穩(wěn)定性很好，即使在沒有選擇壓力存在下，繁殖10代后，其外源基因的丟失率仍為零。在30 ℃,250