嗜熱鏈球菌耐酸機制的初步研究.pdf

1、嗜熱鏈球菌作為酸奶的發(fā)酵劑在后酸化過程中發(fā)揮重要的作用，本論文旨在對嗜熱鏈球菌的耐酸機制進行初步研究，為嗜熱鏈球菌耐酸機制的闡明奠定了基礎(chǔ)，同時也為酸奶后發(fā)酵的控制提供了理論指導(dǎo)。
　　通過對嗜熱鏈球菌在不同乳糖含量的IRIE培養(yǎng)基中培養(yǎng)，明確了嗜熱鏈球菌的生長特征。對處于對數(shù)生長初期的嗜熱鏈球菌進行酸刺激處理1h，采用蛋白質(zhì)組學分析方法對比刺激前后蛋白種類與表達量的變化，結(jié)果為培養(yǎng)到對數(shù)初期(4 h)的蛋白點為665個，酸刺激后

2、(5 h)的蛋白點為677，其中有12個蛋白點在5h樣品中存在而在4h樣品中不存在。提取5h的表達量相對于4h的表達量多于1.5倍以上的70個蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)其在酸性環(huán)境中的功能大致分為以下幾類:與金屬離子壓力相關(guān)的蛋白4種，與逆境下修復(fù)保護機制相關(guān)的蛋白5種，與代謝途徑相關(guān)的一些酶和亞基27種，與ATP合成酶蛋白，轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的蛋白11種，與氨基酸代謝相關(guān)的酶蛋白8種，其他功能蛋白10種。挑選其中四個蛋白Alpha-aceto

3、lactatedecarboxylase、UreaseG、UreaseE和60 KD進行實時定量PCR（RT-qPCR）驗證其在轉(zhuǎn)錄組水平上的表達量變化，結(jié)果5h樣品相對于4h樣品表達量分別為15.24倍、13.27倍、8.40倍和0.60倍，蛋白Alpha-acetolactate decarboxylase、UreaseG和UreaseE在轉(zhuǎn)錄組水平上與蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果一致，而蛋白60 KD卻呈現(xiàn)不一致的變化。
　　CiaH

4、是一種可能的耐酸性相關(guān)基因，本研究成功構(gòu)建了該基因的敲除載體，并進行了初步的敲除實驗。根據(jù)CiaH上、下游基因序列設(shè)計引物，擴增出長度為641 bp和698 bp的上下游同源臂，并利用酶切、連接將其插入到pMD18-T中;PCR擴增氯霉素抗性基因，通過酶切、連接后將其插入到重組pMD18-T載體中的上下游片段之間，成功構(gòu)建基因敲除載體。將敲除載體線性化以后轉(zhuǎn)入嗜熱鏈球菌，在氯霉素抗性平板上篩選基因敲除突變株，經(jīng)過多次篩選未能獲得基因敲除