土曲霉阿魏酸酯酶基因的克隆及在畢赤酵母中的表達.pdf

1、阿魏酸酯酶是一類可降解植物細胞壁阿魏酸與木質素及阿拉伯半糖相連的酯鍵的水解酶。能很好的解聚細胞壁，促進木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等纖維素酶對細胞壁的降解作用。阿魏酸酯酶可應用于造紙、紡織、飼料、食品等輕工行業(yè)。
　　本文采用阿魏酸乙酯平板法從土壤和實驗室菌種庫中篩選出3株產阿魏酸酯酶的絲狀真菌。分別編號為SD01、SD02和SD03，對3株菌分別進行形態(tài)學觀察并進行了18S rDNA序列及ITS序列的克隆。菌株SD01長勢迅速，菌絲與

2、培養(yǎng)基結合緊密呈墨綠色，菌落表面濕潤，孢子梗分生孢子不超過3個，孢子彎如新月，內有3隔室由內向外逐步膨大，孢子隔膜較厚。菌落、孢子形態(tài)結合ITS序列鑒定，該菌株為谷子彎孢菌。菌株SD02生長迅速，菌絲蔓延性強，在PDA培養(yǎng)基上開始呈現(xiàn)白色絨毛狀，逐漸長出金黃色孢子后期孢子轉為黃綠色，孢子蓬松易脫落。孢子頭端部膨大，分生孢子沿著次生小梗均勻排列呈現(xiàn)兩排。菌絲外側有絨毛，內部有隔膜，是典型的黃綠曲霉特征。結合18S rDNA及 ITS序列對

3、比分析結果，認定菌株SD02為黃曲霉。菌株SD03生長遲緩，需要2周分生孢子方鋪滿平板。菌絲致密，在PDA平板上初期白色，后逐漸分化出土褐色孢子，孢子松散易脫落。菌落邊緣呈鋸齒狀，整體呈現(xiàn)螺紋狀。菌落、孢子形態(tài)結合18S rDNA及 ITS序列，認定菌株SD03為：土曲霉（Aspergillus terreus）。
　　本研究以土曲霉SD03作為出發(fā)菌株，采用PCR擴增得到土曲霉SD03的阿魏酸酯酶基因序列，序列分析顯示其中包含兩

4、個外顯子和1個內含子，總長度為787bp。采用重疊拼接PCR將其編碼阿魏酸酯酶基因的兩個外顯子進行拼接，獲得阿魏酸酯酶DNA序列，測序顯示阿魏酸酯酶DNA序列長度為723bp，共編碼341個氨基酸，其中和NCBI報道的土曲霉阿魏酸酯酶蛋白序列有兩個氨基酸的差異，分別是120位的纈氨酸和第121位絲氨酸。利用EcoRI+Avr II雙酶切將土曲霉SD03的阿魏酸酯酶DNA基因插入到表達載體pPIC9K中成功獲得了畢赤酵母表達載體pPIC9

5、K-fae，表達載體的成功構建為下一步的表達奠定了基礎。表達載體pPIC9K-fae，分別經Sal I和Bgl II線性化，利用電轉化法和化學轉化法進行轉化，轉化子長出后涂布在G418梯度平板(最高濃度6mmol/L)進行抗性篩選，結果篩出獲得64株高抗性轉化子。對64株轉化子進行試管誘導發(fā)酵試驗，依據(jù)發(fā)酵液在阿魏酸乙酯平板上產生透明圈的情況篩選出16株有明顯透明圈的轉化子。利用pPIC9K表達盒引物及fae基因特異引物對其進行PCR鑒

6、定篩選，結果獲得6株轉化子。對篩選獲的6株pPIC9K-fae畢赤酵母轉化子進行發(fā)酵性能研究，在甲醇誘導的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后發(fā)酵活力達到最高，以對硝基阿魏酸苯酚酯為底物，利用UV法410nm下測定對硝基酚的吸收值變化量，來測定轉化子發(fā)酵液的酶活，其中轉化子G3菌株的發(fā)酵液活性最高，可達12U/L。對G3菌株的發(fā)酵上清進行SDS-PAGE的電泳分析，結果在分子量大小32Kda左右有1條明顯的條帶。對土曲霉阿魏酸酯酶基因的外源表達有助于