DNA模板點擊化學在生物傳感器中的研究與應用.pdf

1、Cu+催化的炔化物和疊氮化物的偶極環(huán)加成反應是“點擊化學”的典型例子,該反應具有反應條件溫和、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點,已經(jīng)大量用于生物大分子的標記。此外,這種點擊化學反應對Cu+離子催化有很高的特異性,已經(jīng)用于開發(fā)銅離子的生物傳感方法。但傳統(tǒng)的有機點擊反應,需要較高的反應物濃度以及長時間的反應,并且檢測限相對偏高。
　　DNA模板有機合成(DTS)是一種極具創(chuàng)新性的技術。它能顯著地增加反應分子的有效摩爾濃度。同時,通過DNA雜交,

2、拉近了修飾在DNA上的小分子反應基團之間的距離,該方法能明顯的加快反應速率。通過DNA將DNA相關技術引入到非天然合成反應中,有助于反應基團的識別、合成步驟的設計、反應選擇性的提高以及反應的放大。基于上述優(yōu)點,DTS在許多方面都有著廣泛的應用前景,它是小分子庫構建、生物活性分子篩選和多肽均相合成等的有效方法。然而,DTS在生物分析領域的應用仍處于起始階段。雖然前人在這方面研究甚少,但DTS的內(nèi)在優(yōu)勢和強大功能奠定了其在生物傳感中應用的基

3、礎。
　　基于以上考慮,并綜合相關文獻報道,本論文將點擊反應與DTS反應相結合,利用DNA模板點擊化學反應,開發(fā)了一系列新型的化學生物傳感方法。此外,考慮到點擊化學在生物大分子標記上的卓越貢獻,本論文將點擊化學引入到生物大分子自由基的檢測上來,希望能開發(fā)一些更為簡便的檢測生物大分子自由基的方法。
　　(1)構建了一種基于DNA模板點擊化學反應的新型Cu2+的熒光檢測平臺。本方法利用DNA模板點擊化學反應的高特異性用于目標分子

4、識別,DNA鏈取代和磁珠分離作為信號的傳導,高靈敏性的SYBRGreenI染料作為信號輸出。與傳統(tǒng)的點擊反應方法相比較,該方法具有更高的靈敏度和更低的檢測限(290nM)等優(yōu)點。此外,只需要把DNA上的疊氮基-炔基換成其他能形成共價鍵的功能基團就可以把該傳感系統(tǒng)用于其他物質的檢測。這為各種生物傳感器的構建提供了一個很有潛在應用價值的通用平臺。
　　(2)由于在前一個工作中,需要磁珠分離過程,操作比較繁瑣,而且檢測時不是在均相里完成

5、。因此,我們開發(fā)了一個更加簡便的Cu2+傳感方法,可以實現(xiàn)加入混合就能輸出信號。這種方法是基于DNA模板點擊反應生成的G四面體(G4)結構并用于高靈敏檢測Cu2+的新型熒光傳感方法。由于結晶紫與G4結合后能極大地增強其熒光強度,因而被選做信號輸出分子。鑒于結晶紫能探測G4結構的變化,我們把一段富G序列的DNA分開成兩段長度不等的短鏈DNA,然后通過DTS反應使其連接起來并形成分子內(nèi)G4結構,而結晶紫可以用于識別這一結構的變化。由于DTS

6、反應的高產(chǎn)率和點擊化學的高特異性,這種傳感器也展示了較高的靈敏度和選擇性。此外,由于活細胞內(nèi)含有豐富的谷胱甘肽(GSH),本方法可能用于生物體內(nèi)的GSH/Cu(I)加合物檢測。因此,以本方法為例,我們證明了通過合理設計后,DTS調控的分子內(nèi)G4結構的形成在生物傳感器的開發(fā)上具有良好的應用前景。
　　(3)簡便、可視化檢測、可以實現(xiàn)現(xiàn)場化檢測是未來分析檢測方法的發(fā)展趨勢,而比色分析則剛好符合這些要求。因此,我們提出了一種基于Cu+催

7、化的點擊化學反應和未修飾AuNPs作為比色指示劑的Cu2+比色檢測的簡便方法。用于點擊反應的DNA探針由兩部分組成:一部分是一條修飾了疊氮基團的單鏈DNA(ssDNA)與一條長鏈的ssDNA的部分堿基形成的雙鏈DNA(dsDNA);另一部分是一條與長鏈中未雜交的堿基互補的炔基化標記的短鏈ssDNA。由于短鏈ssDNA與長鏈ssDNA形成的dsDNA的熔解溫度很低,在沒有Cu2+的情況下,這兩個部分在溶液中是分開的。當溶液中存在Cu2+時

8、,銅離子催化的疊氮-炔基的點擊連接反應引起了DNA結構從分離的單鏈形式變?yōu)橥暾碾p鏈DNA結構。由于ssDNA保護的AuNPs和dsDNA保護的AuNPs在鹽溶液中的穩(wěn)定性不同,因此可以通過調控未修飾的AuNPs的團聚,使其從紅色變成藍色,來監(jiān)測這種DNA結構的變化。在最佳條件下,這種傳感器具有較高的靈敏度,其線性范圍是0.5-10μM,檢測限可達到250nM。這種方法不需要對DNA進行“雙標記”和對金納米粒子進行表面修飾,從而大大減少

9、了費用和簡化了傳感器的組裝及分析過程。由于銅離子催化的炔基-疊氮基的點擊化學反應的高特異性,本傳感器能夠在高濃度的其他環(huán)境相關金屬離子共存下具有良好的選擇性,符合實際樣品的檢測要求。
　　(4)鑒于點擊化學在生物標記上的成功經(jīng)驗,我們將點擊化學引入到生物大分子自由基的捕獲上來。提出了點擊-捕獲(Click-Trap)設計新概念,合成了多種環(huán)狀硝酮類自由基捕獲探針,并用質譜、核磁等進行了表征。將這些捕獲探針對氧中心和碳中心的小分子自

10、由基進行了ESR捕獲實驗。此外,具有點擊功能的炔基標記的新型捕獲探針(Click-DMPO)也用于蛋白質活性氧自由基的氧化性損傷的原位捕獲實驗。較之于免疫自旋捕獲技術,本方法操作更為簡單,勿需復雜的免疫實驗操作;由于點擊反應的優(yōu)異性能,有利于對Click-DMPO和蛋白質形成的復合物進行進一步的修飾和檢測。
　　另一方面,DNA由于精確的堿基互補配對性質,在納米自組裝方面具有高度可控、可編碼、可圖案化、易于實現(xiàn)目標分子標記等天然優(yōu)

11、勢。其自組裝形成的DNA結構不僅可以在納米尺度上實現(xiàn)復雜結構的精確組裝,而且還具有良好的生物相容性,不僅是一種新型的生物納米材料,而且在分析化學中有著潛在的應用前景。因此,研究基于DNA納米結構的生物傳感技術亦是一項重要和具有挑戰(zhàn)性的工作。
　　(5)發(fā)展了一種基于DNA納米管的質量放大效應的熒光各向異性的高靈敏檢測ATP的傳感方法。一條長鏈的ssDNA探針包含了目標分子的核酸適配體序列的一部分以及用于自組裝形成質量放大熒光各向異