原發(fā)性肝癌術后轉移復發(fā)分子預測模型的優(yōu)化整合與臨床轉化.pdf

1、肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)（簡稱肝癌）是全球最常見的惡性腫瘤之一，在中國肝癌的發(fā)病率居腫瘤發(fā)病率的第三位，而其死亡率居第二位。雖然對肝癌防治的研究已取得巨大進展，根治切除術后的十年生存率已提高到30％左右，但肝癌根治性切除術后5年轉移復發(fā)率仍為60-70％，即使是小肝癌也達43.5％。轉移復發(fā)已成為進一步延長肝癌患者生存期、提高遠期療效的瓶頸，也是最終攻克肝癌的關鍵。探求轉移復發(fā)相關的分子模

2、型可以為肝癌患者預測臨床結果提供有益信息，并為術后甄別需要接受輔助治療的患者提供幫助。
　　肝癌轉移復發(fā)是多因素、多步驟參與的病理過程，是腫瘤細胞自身基因改變和宿主微環(huán)境相互作用的結果。迄今，尚無一個基因或基因組合能夠用于臨床預測肝癌預后，基于傳統(tǒng)的臨床指標和分期只能粗略區(qū)分不同分期的肝癌，無法滿足臨床實踐中個體化治療越來越高的要求。研究肝癌本身生物學特性和宿主免疫相關因素可能更利于理解肝癌轉移復發(fā)的機制以及臨床預測。
　　

3、本所前期采用全基因組微陣列技術，先在肝癌組織中的發(fā)現(xiàn)并建立了153個基因的肝癌轉移復發(fā)預測模型，后又在癌旁組織建立了由17個炎癥免疫相關細胞因子構成的分子預測模型可以準確預測肝癌術后復發(fā)。本研究在前期工作的基礎上，從基因、蛋白各水平進一步驗證和優(yōu)化整合基于癌和癌周組織以及血清的預測標簽、評估其對肝癌術后轉移復發(fā)和生存的預測價值以及對術后復發(fā)的監(jiān)測意義，探索它們向臨床應用轉化的可行性。
　　第一部分，基于組織的肝癌轉移復發(fā)預測模型的

4、優(yōu)化整合與臨床轉化
　　一.基于癌組織的肝癌轉移復發(fā)預測模型的驗證與優(yōu)化
　　目的:肝癌患者預后預測仍然困難，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)基于癌組織的153個基因的預測模型可以預測肝癌術后轉移復發(fā)。本研究擬進一步在大樣本中驗證優(yōu)化此模型，檢驗其對肝癌根治術后轉移復發(fā)的預測效能。
　　方法:應用生物信息學和統(tǒng)計學方法從基于癌組織的153個預測模型中篩選出26個與復發(fā)轉移密切相關的分子，采用qRT-PCR檢測訓練組361例患者肝癌

5、組織中這26個基因的mRNA表達水平。進一步優(yōu)化構建有效的分子預測模型，分析其與肝癌術后轉移復發(fā)的關系，并在288例患者的驗證組中評估預測效能;并對其中重要基因在細胞系水平進行了驗證。
　　結果:在訓練組361例肝癌患者中應用log-rank法分別檢驗26種基因與轉移復發(fā)的關系，按關系的大小排序SPP2(P＜0.01)，ENO2(P＜0.01)，ASPH(P＜0.01)，F(xiàn)KBP10(P＜0.01)及SAFB2(P＜0.01)依次

6、為前5位?；贑ox風險比例回歸模型發(fā)現(xiàn)包含這5個基因的預測模型可以較準確地預測該組361例患者的復發(fā)情況(HR=1.98，95％CI=1.52-2.59; P＜0.001)，并且可作為肝癌術后總體生存期預測指標。根據該模型將驗證組288例患者分為高風險組和低風險組，Kaplan-Meier分析顯示高風險組中位至復發(fā)時間顯著短于低風險組(HR=1.37，95％CI=1.03-1.82; P=0.032)，高風險組中位總生存期也短于低風險

7、組（P＜0.05）。在不同肝癌細胞株中ENO2與ASPH的蛋白表達水平隨著細胞轉移潛能的增加而升高。
　　結論:前期從基因芯片中篩選出的153個基因，經qRT-PCR大樣本驗證優(yōu)化為5基因的預測模型可以較準確預測肝癌術后轉移復發(fā)。
　　二.基于癌旁組織的肝癌預后預測模型的驗證與優(yōu)化
　　目的:進一步在大樣本中驗證優(yōu)化前期基于癌旁組織的免疫炎癥相關因子的預測模型，評估其對肝癌根治術后轉移復發(fā)和生存的預測價值。
　　

8、方法:我們隨機選取了3組在復旦大學附屬中山醫(yī)院行根治性手術切除的肝細胞癌患者，包括訓練組180例，驗證A組200例及驗證B組188例。在訓練組利用熒光定量PCR技術，優(yōu)化驗證癌旁(IL-6、CSF-1、SPP1、TNF及HLADRA)5基因預測模型，然后在驗證A組中對該模型進行驗證;在驗證B組中利用組織芯片、免疫組織化學技術，驗證“癌旁5基因預測模型”的穩(wěn)定性、有效性。
　　結果:在訓練組180例肝癌患者中應用log-rank法檢

9、驗10個與肝癌預后密切相關的因子，排序后IL-6，CSF-1，SPP1，TNF和HLADRA為前5位，應用這5個免疫炎癥相關細胞因子可以區(qū)別肝癌患者預后。基于Cox風險比例回歸模型發(fā)現(xiàn)包含這5個基因的預測模型可以較準確地預測訓練組患者中位總生存情況(HR=2.19，95％CI=1.55-3.08;P＜0.001)。驗證A組200例患者根據閾值被分為高風險組和低風險組，Kaplan-Meier分析顯示高風險組中位生存期顯著短于低風險組(H

10、R=1.37，95％CI=1.03-1.82; P＜0.001)。利用免疫組織化學技術證實驗證B組中CSF-1，SPP1，TNF和HLADRA的蛋白表達水平與mRNA一致。
　　結論:前期的基于肝癌癌旁組織的預測模型經大樣本qRT-PCR驗證優(yōu)化為5基因的預測模型可以較準確預測肝癌術后生存情況。
　　三.癌與癌旁轉移復發(fā)分子預測模型的整合與臨床轉化
　　目的:整合基于癌和癌旁組織的預測模型，在前瞻性研究隊列中進一步評估

11、其預測價值及臨床應用的可行性，組裝預測試劑盒。
　　方法:續(xù)貫納入的368例原發(fā)性肝癌患者作為前瞻性隊列，具有癌與癌旁配對組織樣本。應用Kaplan-Meier法比較不同組間的總生存時間(OS)和至復發(fā)時間(TTR)差異，應用Harrell一致性指數(shù)(C-index)比較兩模型及其與傳統(tǒng)臨床分期的預測準確性，進而優(yōu)化整合提出更為準確的預測模型。
　　結果:根據基于癌或癌旁組織的預測模型所將納入研究隊列的患者歸類為高風險組或低

12、風險組，臨床隨訪觀察其復發(fā)和生存情況，將預期與實際情況對比。研究發(fā)現(xiàn)根據預測模型劃分的高風險患者較低風險患者術后轉移復發(fā)（p＜0.05）及死亡（p＜0.05)的危險均明顯增高。一致性指數(shù)(C-index)比較預測準確性發(fā)現(xiàn)基于癌組織的預測模型對復發(fā)的預測效果更好，基于癌旁組織的預測模型則對生存預測效果較好。將兩者都整合到現(xiàn)有臨床分期系統(tǒng)之后，效能進一步提高，并組裝可用于臨床的預測試劑盒。
　　結論:基于癌與癌旁組織的預測模型在前瞻

13、性隊列中能較為準確的預測肝癌術后轉移復發(fā)與生存，將其與現(xiàn)有臨床分期整合可以提高預測效能。
　　第二部分血清OPN在肝癌術后的動態(tài)變化及其對肝癌復發(fā)監(jiān)測的意義
　　目的:術前血清骨橋蛋白(OPN)已經被證明與腫瘤的預后密切相關，本研究旨在探索肝癌術后血清OPN動態(tài)變化及其在肝癌術后復發(fā)監(jiān)測中的意義。
　　方法:本研究中，我們隨機選取了分別于不同時段(2005年1月-2007年12月，179例，為A組)(2010年2月-2

14、011年12月，110例，為B組)在復旦大學附屬中山醫(yī)院行根治性手術切除的兩組肝細胞肝癌患者，以及另一個包括慢性肝病、肝臟良性腫瘤、正常健康人及轉移性肝癌患者的對照組。收集其血清樣本，采用酶聯(lián)免疫法ELISA檢測OPN的水平。A組和對照組用來確定患者術前OPN的基線水平;B組患者檢測了術前、術后1周、術后1月及術后超過2月的OPN水平，用來分析患者術后OPN的動態(tài)變化。
　　結果:A組術前血清OPN的基線水平為164.3±18.6

15、ng/mL與B組的基本一致，兩組OPN的水平明顯高于對照組中的慢性肝病(p＜0.0001)、轉移性肝癌(p＜0.0001)以及肝臟良性腫瘤(p＜0.0001)的患者。在B組中術后1周的血清OPN水平(214.4±14.1 ng/mL)明顯高于術前水平，但在術后1月時回落到近似于慢性肝病組水平(47.6±5.4 ng/mL)，術后2月下降到最低值(36.3±5.9ng/mL)。肝癌復發(fā)時，血清OPN水平再次升高，而當復發(fā)的腫瘤再次被手術切

16、除后，OPN水平又開始下降，呈現(xiàn)與第一次手術后一致的現(xiàn)象。而且無論在甲胎蛋白(AFP)陰性或陽性的患者中都呈現(xiàn)這一變化模式。術后血清OPN水平與肝功能及C反應蛋白水平相關。
　　結論:肝癌患者血清術前OPN水平較對照明顯升高，并在術后經短暫升高后約5周后逐漸下降;當肝癌復發(fā)時血清OPN再次升高并且AFP陰性患者也有此規(guī)律，因此肝癌術后血清OPN變化可以作為肝癌根治術后病程觀察和監(jiān)測復發(fā)的依據。
　　全文總結
　　1.經

17、驗證優(yōu)化后，基于肝癌組織的5基因的預測模型能較為準確的預測肝癌術后復發(fā)，癌旁組織中的5基因的預測模型能較為準確的預測肝癌術后生存，經大樣本前瞻性驗證具有臨床應用價值。
　　2.肝癌患者血清術前OPN水平較正常人及肝硬化患者明顯升高，并在術后經短暫升高后約5周逐漸下降;當肝癌復發(fā)時血清OPN再次升高并且AFP陰性患者也有此規(guī)律，肝癌術后血清OPN變化可以作為肝癌根治術后病程觀察和監(jiān)測復發(fā)的依據。
　　創(chuàng)新點
　　1.驗證

18、優(yōu)化整合得出穩(wěn)定的基于癌與癌旁組織的肝癌轉移復發(fā)預測模型。
　　2.開發(fā)并組裝了預測肝癌術后轉移復發(fā)與生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒。
　　3.首次報道肝癌患者血清OPN可替代AFP作為肝癌術后轉移復發(fā)的檢測指標。
　　潛在應用價值
　　1.優(yōu)化驗證整合癌組織153基因模型和癌周17個免疫因子預測模型，得出確實可信、實用的模型，向臨床轉化邁出了堅實的一步。
　　2.本研究中已經申請國家專利2項:“預測