鈣網(wǎng)蛋白調(diào)控的Ca2+信號(hào)途徑在應(yīng)力介導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:在細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)凋亡通路是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表現(xiàn)包括鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，鈣網(wǎng)蛋白(CRT)，蛋白折疊酶及凋亡因子的活化，其中鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的升高也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志之一。但鈣網(wǎng)蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用一直具有爭(zhēng)議，甚至出現(xiàn)了很多相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們分析這與不同的刺激因素及細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樘接懼芷谛詮垜?yīng)力刺激下鈣網(wǎng)蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為將來(lái)以基因?yàn)榘悬c(diǎn)矯治錯(cuò)頜畸形提供理

2、論支持。
　　 方法:(1)建立成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)應(yīng)力刺激模型。(2)采用細(xì)胞牽張加力儀對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞分別加力0h、1h、6h、12h和24h的周期性張應(yīng)力，利用hochest染色，及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在刺激因素下的變化。(3)利用RT-PCR檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白mRNA的表達(dá)變化，利用蛋白免疫印跡檢測(cè)鈣網(wǎng)蛋白在蛋白水平的表達(dá)(4)利用Fluo-3/AM檢測(cè)鈣離子濃度及利用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)相關(guān)酶的活性變化。
　　 結(jié)果:(1)隨著加

3、力時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞凋亡隨著加力時(shí)間而增加，加力6小時(shí)后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡(p＜0.01)。(2)周期性張應(yīng)力刺激下CRT mRNA及蛋白表達(dá)隨著細(xì)胞凋亡的增加表達(dá)量增多，12h最為明顯(p＜0.01)。(3)在應(yīng)力刺激下細(xì)胞中胞漿Ca2+濃度比不加力組明顯升高(p＜0.05)。(4) CRT的表達(dá)量與Ca2+-ATPase呈負(fù)相關(guān)(r=-0.74)，CRT的mRNA的表達(dá)與Ca2+濃度呈正相關(guān)且與CaN呈正相關(guān)。