兩株抗JEV單抗可變區(qū)的基因克隆、計算機建模及其與JEV E蛋白的分子對接.pdf

1、日本腦炎病毒(JEV)是黃病毒科、黃病毒屬主要成員,病毒通過蚊子叮咬傳播,可引起人類急性中樞神經系統(tǒng)傳染性疾病—日本腦炎(我國也稱流行性乙型腦炎,簡稱乙腦),主要發(fā)病人群為兒童,重癥病死率較高,近三分之一的幸存者留有各種各樣的神經系統(tǒng)后遺癥,仍然嚴重威脅公眾健康。隨著全球氣候暖化,日本腦炎病毒的流行地域也不斷擴大,成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
　　JEV E蛋白是病毒主要的結構蛋白之一,參與病毒吸附、穿入,與其致病性密切相關。本課題

2、組制備了兩株具有高中和活性的抗JEV單克隆抗體(2H4和2F2),并在多種感染動物模型上證實了其顯著的被動保護作用,但抗體與JEV相互作用的機制尚未完全闡明。因此,本研究利用分子生物學方法獲得2H4和2F2抗體可變區(qū)基因,原核表達并純化了2H4和2F2重鏈可變區(qū),確認了原核表達的重鏈可變區(qū)產物與JEV的結合活性,利用計算機軟件構建了2H4和2F2可變區(qū)的空間模型,再與已有的JEV E蛋白空間模型進行了模擬分子對接,了解了對抗體結合活性有

3、重要影響的關鍵氨基酸,為最終闡明抗體中和作用機制奠定了實驗基礎。具體研究內容和結果如下:
　　1.確定了2H4、2F2可變區(qū)基因
　　培養(yǎng)2H4、2F2雜交瘤細胞,經RNA提取試劑RNAiso Plus提取細胞總RNA。根據GenBank中鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因序列,設計出分別針對FR1和FR4的上、下游引物,以總 RNA為模板擴增2H4、2F2可變區(qū)基因。進行了2H4、2F2重鏈和輕鏈可變區(qū)基因核苷酸序列同源性分析(BLA

4、STN,此過程在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫中進行),并用IMGT/V-QUEST分析了可變區(qū)結構,確定了2H4、2F2單抗可變區(qū)CDR和FR。結果顯示,這些序列包含典型的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域以及 FR1～FR4區(qū)域,完全符合鼠源性 IgG抗體可變區(qū)基因的特征。2H4、2F2輕鏈可變區(qū)基因均長321 bp,編碼107個氨基酸,第92位含一個半胱氨酸,并且序列完全相同。2個重鏈可變區(qū)基因序列長354 bp,

5、編碼118個氨基酸,第22位和第96位含有維持抗體結構的半胱氨酸。
　　2.原核表達了2H4、2F2重鏈可變區(qū)并確認了與JEV的結合活性
　　為了便于純化,選用pRSET A載體。2H4、2F2重鏈可變區(qū)表達產物經鎳離子親和層析純化、透析,間接ELISA實驗證實2H4、2F2重鏈可變區(qū)表達產物可與JEV結合。
　　3.2H4、2F2單抗可變區(qū)的同源建模
　　根據2H4、2F2可變區(qū)基因,利用BLASTP軟件(ww

6、w.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTP)在蛋白質數據庫(PDB)中搜索相關蛋白,獲得了單抗可變區(qū)的同源蛋白,完成了氨基酸序列同源性分析。利用軟件MODELLER9v1,以同源蛋白為模板對單抗可變區(qū)的主鏈、側鏈進行結構建模,組裝出完整的2H4、2F2單抗可變區(qū)三維結構模型,再對初始結構模型進行了一系列分子動力學優(yōu)化,最終獲得了單抗可變區(qū)三維結構的能量最低構象。
　　4.2H4、2F2單抗可變區(qū)與JEV E蛋白的模擬分子對

7、接
　　利用Discovery Studio v2.1軟件模擬了單抗可變區(qū)與E蛋白的分子對接,結果顯示:E蛋白上與2H4單抗可變區(qū)作用的氨基酸位點有5個,分別是16位絲氨酸、37位天冬氨酸、353位精氨酸、375位谷氨酸和378位苯丙氨酸殘基;2F2單抗可變區(qū)作用則有9個,分別是13位谷氨酸、16位絲氨酸、37位天冬氨酸、300位蘇氨酸、336位賴氨酸、347位天冬氨酸、354位亮氨酸、387位精氨酸和388位甘氨酸殘基。在所有位

8、點中,13位谷氨酸、16位絲氨酸、37位天冬氨酸和300位蘇氨酸在E蛋白結構域Ⅰ區(qū)內,其余均在已報道過的E蛋白結構域Ⅲ區(qū)內。2H4、2F2單抗同時識別的16位絲氨酸和37位天冬氨酸可能是結構域Ⅰ區(qū)中和表位的關鍵氨基酸所在。2F2的13位谷氨酸和300位蘇氨酸也未曾報道。2H4的353位精氨酸未見報道,但375位谷氨酸和378位苯丙氨酸與2F2的387位精氨酸和388位甘氨酸均位于優(yōu)勢中和抗原表位集中的結構域Ⅲ區(qū)內。2F2的336位賴氨酸