新型化合物FLZ對熱休克蛋白的誘導(dǎo)作用和對實驗性帕金森氏病模型多巴胺系統(tǒng)保護作用及機制的研究.pdf

1、帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其發(fā)病率僅次于老年癡呆(Alzheimer’disease,AD),是第二常見的神經(jīng)退行性疾病。PD的主要病理特征為患者黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元選擇性丟失,以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)路易式小體(Lewy body,LB)的形成,這些病理變化最終導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)功能低下而膽堿能神經(jīng)功能相對占優(yōu)勢,從而產(chǎn)生運動障礙。PD的主要臨床癥狀是靜止性震顫、僵直

2、、反應(yīng)遲鈍、身體姿勢和運動平衡失調(diào)等。
　　 PD的發(fā)病機制十分復(fù)雜,目前還不十分清楚。一般認(rèn)為基因和環(huán)境因素共同導(dǎo)致了PD。與PD相關(guān)的發(fā)病機制包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集以及炎癥。目前,對于PD的治療都只能改善癥狀,不能延緩疾病的進展,因此,迫切需要開發(fā)既能改善癥狀又能延緩疾病進程的藥物。
　　 FLZ是一個新型的番荔枝酰胺衍生物,前期研究證實具有很強的神經(jīng)保護作用,可以改善實驗性AD和實驗性

3、PD動物的行為學(xué)障礙,同時在體外對多種損傷劑引起的神經(jīng)元凋亡具有明顯的保護作用,是一個很有開發(fā)前景的新型化合物。本研究采用SH-SY5Y細(xì)胞株、PD大鼠模型和MN9D細(xì)胞株對FLZ的神經(jīng)保護作用及作用機制進行研究。本論文分為以下三個部分:
　　 第一部分:新型化合物FLZ對SH-SY5Y細(xì)胞熱休克蛋白的誘導(dǎo)作用及其在MPP+引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷中的保護作用
　　 熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs

4、)是一種重要的分子伴侶,在神經(jīng)退行性疾病中具有重要的保護作用,上調(diào)細(xì)胞中熱休克蛋白的水平是一種極富前景的治療蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病的策略。前期研究表明,FLZ在多種實驗性PD模型中均具有較好的保護作用,但FLZ的神經(jīng)保護機制尚不十分明確。本實驗主要研究FLZ對熱休克蛋白的誘導(dǎo)作用及其在抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果表明,FLZ可以時間和劑量依賴性的誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中HSP27和HSP70蛋白和mRNA表達(dá)。進一步研

5、究表明FLZ可以激活熱休克因子(HSF1),促進其入核和磷酸化,FLZ還可激活HSF1調(diào)節(jié)激酶Akt,增加其磷酸化水平。當(dāng)用PI3K抑制劑LY294002抑制Akt活性后,FLZ誘導(dǎo)的HSF-1的活化及HSP27和HSP70表達(dá)也同時被抑制,表明FLZ對熱休克蛋白的誘導(dǎo)作用與其激活A(yù)kt有關(guān)。此外,熱休克蛋白生成抑制劑槲皮素(Quercetin)可抑制FLZ誘導(dǎo)的HSF1活化及HSP27和HSP70的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,采用MPP+損傷的

6、SH-SY5Y細(xì)胞評價了HSP27和HSP70在FLZ神經(jīng)保護中的作用。結(jié)果顯示,提前給予FLZ可以顯著誘導(dǎo)HSP27和HSP70的表達(dá),DAPI染色和流式檢測結(jié)果表明FLZ可明顯抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,同時給予槲皮素后,FLZ對MPP+損傷的細(xì)胞保護作用顯著降低,表明FLZ誘導(dǎo)的HSP27和HSP70在其神經(jīng)細(xì)胞保護作用中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果為闡明FLZ的神經(jīng)保護作用機制提供了新的解釋。
　　 第二

7、部分:新型化合物FLZ對6-OHDA誘發(fā)的PD大鼠模型的保護作用及機制研究
　　 本研究主要考察FLZ對6-OHDA誘發(fā)的大鼠PD模型多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)的影響。采用大鼠黑質(zhì)內(nèi)立體定位注射6-OHDA建立PD模型,2W后篩選模型成功的大鼠進行實驗。大鼠灌胃FLZ20 mg/kg,35 mg/kg和50mg/kg,每天一次,連續(xù)4W,每2 W檢測一次行為學(xué)。末次給藥后斷頭取腦,用于免疫組化檢測黑質(zhì)和紋狀體酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元

8、數(shù)量、免疫印跡、HPLC分析和免疫共沉淀等研究。結(jié)果顯示FLZ能明顯抑制黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡,提高紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)的水平,從而改善阿撲嗎啡誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為。對其機制研究發(fā)現(xiàn)6-OHDA能引起DA合成限速酶TH及其活性形式磷酸化的酪氨酸羥化酶(p-TH)表達(dá)的降低,FLZ可明顯提高TH和p-TH的表達(dá)。FLZ對DA的主要代謝酶MAO-B的活性無明顯影響。表明FLZ提高DA的水平作用主要是通過提高TH的表達(dá)而實現(xiàn)的。此外,研究發(fā)

9、現(xiàn)FLZ也可明顯抑制由6-OHDA引起的α-synuclein、caspase-3和RTP801蛋白表達(dá)的升高及p-Akt表達(dá)的降低。以上研究結(jié)果表明FLZ能活化Akt,抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和RTP801,從而促進多巴胺能神經(jīng)元的存活,并因此提高了TH的表達(dá)。此外,FLZ還可以抑制α-synuclein與TH的結(jié)合從而促進TH的磷酸化并因此提高DA的水平,發(fā)揮其抗帕金森病的作用。
　　 第三部分:FLZ對MPP+和

10、6-OHDA損傷的MN9D細(xì)胞多巴胺系統(tǒng)的保護作用及機制研究
　　 本部分研究旨在進一步證實FLZ對多巴胺系統(tǒng)的保護作用并對其機制進行探討。采用MPP+和6-OHDA損傷MN9D細(xì)胞考察FLZ的保護作用及其可能的作用機制。研究結(jié)果顯示,FLZ對MPP+和6-OHDA損傷MN9D細(xì)胞具有明顯的保護作用,對MPP+和6-OHDA引起的MN9D細(xì)胞內(nèi)DA含量降低有一定的抑制作用。深入研究發(fā)現(xiàn)FLZ可以抑制由MPP+和6-OHDA引起的

11、MN9D細(xì)胞內(nèi)p-TH表達(dá)的降低,對MAO-B的活性無明顯影響。FLZ還可明顯抑制由MPP+和6-OHDA引起的RTP801蛋白表達(dá)的升高及p-Akt表達(dá)的降低。FLZ還抑制6-OHDA引起的α-synuclein表達(dá)的升高,并抑制α-synuclein與TH的結(jié)合促進14-3—3ζ與TH的結(jié)合。此外,當(dāng)用LY294002抑制FLZ對Akt的激活后,FLZ對6-OFIDA損傷MN9D細(xì)胞的保護作用減弱,提示Akt信號通路在FLZ治療PD

12、中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.FLZ是一種新型的HSP27和HSP70誘導(dǎo)劑,HSP27和HSP70在FLZ的神經(jīng)保護作用中具有一定的調(diào)節(jié)作用。
　　 2.FLZ治療PD與其降低6-OHDA引起的α-synuclein的表達(dá),抑制α-synuclein與TH的結(jié)合促進14-3-3ζ與TH的結(jié)合從而促進TH的磷酸化,增加多巴胺的合成有關(guān)。
　　 3.FLZ可抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase