Ghrelin對棕櫚誘導的大鼠主動脈內皮細胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、前言：
　　 Ghrelin是一種由28個氨基酸組成的多肽,主要來源于胃。以?；头酋；瘍煞N分子形式存在。Ghrelin是生長激素的內源性配體,能夠刺激生長激素分泌和通過依賴生長激素增加攝食和減少脂肪利用,從而導致能量正平衡。Ghrelin還發(fā)揮多種外周作用,包括胰腺的外分泌和內分泌功能、糖代謝、心血管系統、胃的分泌作用和睡眠。Ghrelin通過抑制凋亡發(fā)揮對多種細胞的保護作用,如脂肪細胞、皮質神經細胞、胰島β細胞、心肌細胞

2、和內皮細胞。Ghrelin被證實能夠與正常人和鼠的心血管組織結合,近期有許多關于ghrelin心血管作用的研究,但其細胞及分子機制不明確。有研究表明高心血管疾病風險的病理狀態(tài)下,如單純性肥胖、胰島素抵抗、高血壓病和2型糖尿病,其血漿ghrelin水平是的降低的。內皮細胞受損是糖尿病相關的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)和心血管并發(fā)癥發(fā)生的關鍵事件。細胞凋亡的增加與內皮受損及心血管疾病相關。游離脂肪酸參與導致內皮細胞功

3、能失調、動脈粥樣硬化及炎癥反應。棕櫚酸是體內含量最多的游離脂肪酸,研究表明棕櫚酸能夠增加體外培養(yǎng)的人血管內皮細胞凋亡及增加活性氧的生成。有研究表明,Ghrelin能夠對多種外來刺激下的血管內皮細胞發(fā)揮保護作用,但是未見關于ghrelin對棕櫚酸環(huán)境中內皮細胞的保護作用研究的報道。
　　 氧化應激參與絕大多數心血管疾病,氧化應激與抗氧化能力的失衡可能導致內皮細胞功能失調。許多存活因子通過活化特殊的信號通路抑制凋亡信號的級聯反應。細

4、胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Pphosphatidylinositol-3-kinase/Akt)參與調節(jié)細胞存活,已有研究表明該通路在ghrelin的保護機制中發(fā)揮重要作用,然而該信號通路在ghrelin的保護效應中的細胞內信號機制不明確?；谶@些觀察,我們設想ghrelin能夠保護棕櫚酸誘導的血管內皮細胞損傷。該實驗中我們研究了棕櫚酸對細胞增殖的影響和對棕櫚酸誘導的大鼠主動脈內皮細胞凋亡的影響。因為氧化應激在凋亡中發(fā)揮重要作用

5、,我們研究了ghrelin對棕櫚酸誘導的活性氧生成的影響。因為Bcl-2通過與促凋亡的Bax蛋白結合起到抑制凋亡的作用,所以有理由相信Bcl-2與Bax的比率是決定細胞命運的一個重要因素。最后,我們研究了ghrelin對于Bcl-2與Bax蛋白比率的影響。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 Wistar大鼠;胃饑餓素(Ghrelin),不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA),棕櫚酸(PA),hoech

6、st33258,MTT,PI3K/AKT阻斷劑LY294002,ERK1/2阻斷劑PD90859;實驗使用的蛋白抗體有AKT及其第473位絲氨酸磷酸化一抗,Caspase3活性檢測試劑盒;AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒。
　　 二、實驗方法
　　 1、大鼠主動脈內皮細胞的原代、傳代培養(yǎng)及鑒定雄性大鼠通過腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉,分離胸主動脈并將其浸入PBS中,用鑷子迅速剝離脂肪或周圍組織?？v行剪開主動

7、脈,于血管內膜滴加0.1％Ⅰ型膠原酶,37℃消化30分鐘。用剪刀將血管剪成大致2mm見方的小塊,內膜朝下貼于6孔板中,滴加少許DMEM,將6孔板于37℃溫箱中倒置約1小時,然后加入培養(yǎng)基,每3天換液。組織塊周圍細胞生長達80-90％融合時用0.25％胰酶消化,離心后接種于6孔板,每2-3天換液。細胞生長達90％融合時用0.25％胰酶消化傳代。組織塊或細胞培養(yǎng)過程中使用DMEM培養(yǎng)基,其中添加20％胎牛血清、1％青-鏈霉素、0.15mg/

8、ml的內皮細胞生長添加物,于37℃含5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3-5傳代細胞用于實驗。通過其鋪路石樣形態(tài)及Ⅷ因子檢測鑒定內皮細胞。
　　 2、MTT法檢測細胞活性細胞接種于96孔板中,每孔含100μl培養(yǎng)液,加入20μl of MTT工作液(5mg/ml),37℃避光孵育4h,加入150μl二甲基亞砜(DMSO)。于570 nm下測定吸光度。
　　 3、Hoechst33258檢測細胞凋亡將各組處理后的細胞用PBS洗

9、2次,4％多聚甲醛固定10min,加100μl Hoechst33258染色,室溫下放置10分鐘,PBS洗2次后于熒光顯微鏡下觀察。
　　 4、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡將細胞洗滌、消化、重懸,行細胞計數,每管細胞含1×106個細胞。重懸細胞后加入160μl annexin V-FITC細胞結合液,室溫避光孵育10min,收集細胞并重懸,加入190μl annexin V-FITC細胞結合液,加入碘化丙

10、啶染色液,流式細胞儀檢測。
　　 5、分光光度計檢測caspase-3活性細胞用PBS洗2次,2000rpm/min離心5min,去除PBS,沉淀細胞中加入50μl冰冷裂解液和0.5μl DTT,冰上裂解60min,4℃10000rpm/min離心1min,加50μl2×2×Reaction Buffer/DTTMix,加5μL caspase-3 substrate(Ac-DEVD-pNA),37℃4h。分光光度計在400nm

11、波長測定其吸光值。
　　 6、細胞內活性氧檢測應用DCFH-DA通過流式細胞儀檢測細胞內活性氧,將細胞用無血清培養(yǎng)基洗二次,加入HBSS稀釋的DCFH-DA(2μmol/L)熒光探針37℃繼續(xù)孵育20min,培養(yǎng)結束后用冰PBS洗脫二次,收集細胞,流式細胞儀進行分析。
　　 7、Western blot分析磷酸化Akt、總Akt、Bax和Bcl-2用RIPA裂解液裂解細胞,提取蛋白質,進行10％SDS-PAGE,1×TB

12、S(pH7.6)洗3次,轉膜后5％脫脂奶粉封閉2h,加一抗4℃孵育過夜,加入辣根過氧化酶標記的二抗雜交2h,洗膜后ECL超敏發(fā)光液進行顯色,結果用Scion Image分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。
　　 8、統計學分析應用SPSS13.0統計軟件進行分析,結果用均數±標準差(x-±s)表示,每組實驗重復3次或3次以上,分析方法采用單因素方差分析,組間差異比較采用Dunnett's檢驗,P＜0.05差異有顯著性。
　　

13、 結果：
　　 1、大鼠主動脈內皮細胞呈鋪路石樣生長,Ⅷ因子染色陽性。
　　 2、MTT檢測結果顯示ghrelin孵育細胞24h在加入或不加棕櫚酸情況下均增加細胞活性(P＜0.05)。
　　 3、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示,棕櫚酸孵育細胞24h增加細胞凋亡(P＜0.01),Ghrelin與棕櫚酸共同孵育細胞較棕櫚酸單獨作用下細胞凋亡減少(P＜0.01)。0.3mM棕

14、櫚酸孵育細胞24h顯著增加caspase-3活性(P＜0.01),Ghrelin與棕櫚酸共同孵育細胞較棕櫚酸單獨作用下caspase-3降低(P＜0.05)。
　　 4、Ghrelin(100nM)迅速增加Akt磷酸化,30min達高峰,至少持續(xù)60min。Ghrelin呈劑量依賴性活化Akt。PI3K抑制劑,LY294002抑制ghrelin誘導的Akt磷酸化(P＜0.01)。Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示,L

15、Y294002降低了ghrelin抑制棕櫚酸誘導細胞凋亡的作用(P＜0.01)。
　　 5、0.3 mM棕櫚酸孵育細胞24h較對照組增加ROS生成(P＜0.01),棕櫚酸與ghrelin共同作用下ROS的生成較棕櫚酸單獨作用下減少(P＜0.05)。
　　 6、0.3 mM棕櫚酸孵育細胞24h降低了Bcl-2/Bax比率(P＜0.01),ghrelin與棕櫚酸共同作用下較棕櫚酸單獨作用下增加了Bcl-2/Bax比率(P＜0

16、.01)。
　　 結論：
　　 1、0.3mM棕櫚酸作用下增加細胞凋亡。
　　 2、Ghrelin抑制棕櫚酸誘導的大鼠主動脈內皮細胞凋亡。
　　 3、Ghrelin通過降低棕櫚酸誘導的ROS生成增加起到細胞保護作用。
　　 4、Ghrelin誘導內皮細胞Akt磷酸化,PI3K阻斷劑LY294002降低了ghrelin對棕櫚酸誘導的細胞凋亡的抑制作用,提示ghrelin對細胞的保護作用至少是部分通過