PRL-3通過調控RhoA活性及mDia表達促進肺癌細胞遷移侵襲.pdf

1、PRLs(phosphatases of regenerating liver)是一類蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase，PTP)，它們能夠通過調節(jié)酪氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)實現(xiàn)對蛋白質活性的調控，進而參與多種細胞生命活動。越來越多的研究結果提示PRL-3與腫瘤密切相關[1-5]。PRL-3在多種惡性腫瘤中均有不同程度的表達上調，尤其在轉移灶中表達水平往往明顯高于原發(fā)灶。這些研究結果都提示PRL-3可能

2、有促進腫瘤轉移的生物學作用，PRL-3可以作為腫瘤轉移的分子標記物[3]。我們課題組研究了94例非小細胞肺癌和癌旁正常組織中PRL-3的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中PRL-3表達陽性表達率為68％，PRL-3陽性表達與非小細胞肺癌的TNM分期、淋巴結轉移呈正相關。但PRL-3調控肺癌侵襲轉移的機制尚不清楚。我們通過siRNA干擾肺腺癌細胞系A549中PRL-3表達，觀察肺癌細胞增殖、遷移侵襲能力的改變，檢測RhoA活性及其下游蛋白m

3、diaphanous(mDia)的表達變化以深入揭示PRL-3影響肺癌細胞侵襲轉移能力的作用機制。 材料與方法： 1、細胞株與試劑 HBE(Normal human bronchial epithelial cells)，人肺腺癌細胞株A549、人大細胞肺癌細胞株NCI-H661和NCI-H460、人肺鱗狀細胞癌細胞系SK-MES-1。羊多克隆PRL-3抗體購自Santa Cruz公司，鼠單克隆mDial抗體購自

4、BD生物科技公司；RT-PCR試劑盒購自Takara公司；Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司；PRL-3siRNA及亂序siRNA對照由Genzyme公司Beverly A Teicher惠贈(Xeragon/Qiagen；target sequence：TGAGAGCGGGATGAAGTACGA：siRNA Negative-1，Ambion)。 2、細胞培養(yǎng) 人永生化正常支氣管上皮細

5、胞系HBE常規(guī)培養(yǎng)于含15％胎牛血清、100U/mL青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中；人肺腺癌細胞A549、NCL-H661、NCLPH460、SK-MES-1常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。RhoA，mDia抑制試驗A549細胞在含anti-RhoA抗體，anti-mDia1抗體100ng/mLDMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時。 3、PRL-3 siR

6、NA轉染 收集指數(shù)生長期的A549細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×109個/L，接種細胞至24孔培養(yǎng)板上，按每孔接種5×104個細胞，并設復孔3個以校正實驗誤差．按Lipofectamin TM 2000操作說明書進行轉染操作。 4、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 提取細胞總RNA,按RT-PCR(TaKaRa)試劑盒方法進行逆轉錄反應，反應體系為20μl，取2μl的RT產物進行PCR反應，反應體

7、系為20μL。 5、細胞免疫熒光染色 將胰酶消化后的細胞均勻接種在24孔板上，4％多聚甲醛室溫固定15min,正常山羊血清37℃封閉30min，滴加PRL-3一抗、二抗，或Phalloidin-TRITC(SIGMA)10μg/mL DAPI37℃孵育30min。 6、SDS-PAGE電泳和Western Blot 提取細胞總蛋白。電泳、轉印，一抗、二抗，DAB顯色。 7、生長曲線測定(MTT)

8、 以103個細胞/孔的密度，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內，置于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每過24h每組各取6孔細胞檢測增殖情況。每孔內加入20μL MTT溶液，150μLDMSO，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。 8、細胞遷移和侵襲能力檢測 細胞遷移能力檢測，上室中加入100μL無血清DMEM培養(yǎng)基，細胞數(shù)為2.5×104個，下室加入600μL含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h

9、r后吸盡培養(yǎng)基，固定，蘇木素染色，鏡下觀察。細胞侵襲能力的測定用預冷的無血清培養(yǎng)基以1:7稀釋Matrigel加入上室100μL，在室溫下放置6h。其他與遷移實驗相同，培養(yǎng)18hr后觀察結果。 9、RhoA活性測定 實驗按照G-LISATM RhoA Activation Assay Biochem Kit使用說明進行操作。酶標儀波長490nm檢測吸光度。 10、統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟

10、件，兩組樣本采用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，兩組以上樣本采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、PRL-3 mRNA及蛋白在高轉移能力的A549細胞和NCI-H661細胞中高表達，在永生化正常人支氣管上皮細胞HBE中低表達。 2、PRL-3在高轉移細胞系A549中的定位不同于永生化的正常人支氣管上皮細胞系HBE。 3、PRL-3 siRNA有效地干擾了A549細胞中PRL-3 mRNA和蛋白的表達

11、。 RT-PCR和western blot檢測結果顯示當轉染PRL siRNA 48h后，A549細胞PRL-3的mRNA和蛋白表達水平開始下降，至72h時間點表達量達到最低。 4、特異性干擾PRL-3表達后A549細胞增殖能力未發(fā)生明顯變化。 5、特異性干擾PRL-3表達后A549細胞遷移、侵襲能力均顯著下降。 6、特異性干擾PRL-3表達后A549細胞RhoA活性顯著下降；mDia蛋白表達水平明顯下調

12、。 7、封閉RhoA，A549細胞mDia蛋白表達明顯降低，與正常A549細胞相比細胞內F-actin表達明顯減弱，張力絲明顯減少，細胞未見明顯偽足形成；封閉mDia，與正常A549細胞相比細胞內F-actin表達明顯減弱，張力絲明顯減少。 結論： 1、PRL-3的表達與肺癌細胞系的遷移侵襲能力有關。 2、PRL-3通過調控RhoA活性及mDia表達調節(jié)細胞F-actin骨架的形成從而實現(xiàn)促進肺癌細胞遷移