人乳腺癌組織中D2-40標記的微淋巴管密度與VEGF-A、VEGF-C表達關系的研究.pdf

1、研究背景及目的：乳腺癌是一個復雜的全身性惡性疾病，研究表明乳腺癌組織生長超過0.2cm～0.3cm大小時，在許多正負調控因子的相互作用下就開始了新生脈管的形成，供應腫瘤生長所必需的氧氣和營養(yǎng)物質。但是至今乳腺癌誘導淋巴管生成的分子機制以及新生淋巴管與乳腺癌淋巴道轉移問的確切關系尚不甚明確。研究表明血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factorA，VEGF-A)是目前已知的對血管生成起直接作用的重

2、要因子之一，能刺激血管內皮細胞增生和遷移，而血管內皮生長因子C(Vascular endothelial growth factor C，’VEGF-C)可能和腫瘤淋巴管生成有關，有望成為體內重要的促淋巴管生成因子。新生的毛細血管與毛細淋巴管在許多方面極其相似，以往對腫瘤淋巴管生成的研究因為缺乏淋巴管內皮細胞特異性標記物，僅依靠普通的HE染色技術很難將它們在形態(tài)學上與毛細血管截然區(qū)分，因此對腫瘤新生淋巴管生成的研究遠遠滯后于對腫瘤新生血

3、管生成的研究。近年來，雖然血管內皮生長因子受體3(Vascular endothelialgrowth factor receptor3，VEGFR-3)、淋巴管內皮透明質酸受體(Lymphatic vesselcell edothelial hyaluronan receptor，LYVE-1)等一些淋巴管內皮細胞標記物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但最近多項研究證實這些常用標記物不僅在淋巴管內皮細胞中表達，而且在血管內皮細胞中也有表達，影響了在形態(tài)學

4、上對腫瘤微淋巴管和腫瘤微血管的區(qū)分。1999年Marks等發(fā)現(xiàn)的D2-40分子是一種可以和胚胎睪丸細胞膜及干細胞膜表面的癌胚抗原M2A(一種分子量為40KD的O鏈-唾液酸糖蛋白)發(fā)生特異性免疫反應的單克隆抗體。2006年最新的研究發(fā)現(xiàn)D2-40在淋巴管內皮細胞上有固定的抗原決定簇，可以用來標識惡性黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、腎細胞癌等多種腫瘤的新生微淋巴管，在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和微血管內皮上沒有表達，因此其有望成為一種新的淋巴管內皮

5、特異性標記物。但應用D2-40單抗標記乳腺癌組織中微淋巴管的研究卻罕見報道。 本研究旨在對比CD31標記的微血管，觀察乳腺癌組織中D2-40標記的微淋巴管的形態(tài)及分布特征，通過半定量方法分析VEGF-C、VEGF-A在mKNA轉錄和蛋白翻譯水平上的表達情況及其與乳腺癌腋淋巴結轉移、臨床分期、P53和C-erbB-2等與乳腺癌預后相關的臨床病理學因素之間的相關性，并進一步探討D2-40標記的微淋巴管密度與VEGF-A、VEGF-C

6、的表達及乳腺癌腋淋巴結轉移的關系，為繼續(xù)研究乳腺癌轉移的分子機制和尋找更新的與乳腺癌患者生存有關的預后因子提供了理論基礎和實驗依據(jù)。實驗方法：收集沈陽軍區(qū)總醫(yī)院2003年1月～2006年10月存檔的乳腺癌術后組織石蠟標本102例和乳腺纖維腺瘤標本25例。應用免疫組化SP法及原位雜交方法檢測VEGF-A、VEGF-C的蛋白質表達水平及VEGF-C mRNA的豐度，采用半定量方法進行染色結果判斷及分析；應用單標免疫組化SP法及雙標免疫組化法

7、(藍紫色的BCIP/NBT顯色系統(tǒng)和鮮紅色的AEC顯色系統(tǒng))檢測D2-40和CD31標記的腫瘤新生脈管的的表達情況，并在顯微鏡下計數(shù)D2-40陽性微淋巴管密度(Lymphaticmicrovessels density，LMVD)。采用SPSS14.0統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗、x<'2>檢驗、方差分析等統(tǒng)計分析。 實驗結果：102例人乳腺癌組織中D2-40僅標記于CD31陰性且管壁薄、形態(tài)不規(guī)則、管腔大小不一的微淋巴管上，在富含肌

8、層的成熟淋巴管和微血管上不表達。本組D2-40反應陽性率為76.5﹪(78/102)，中位LMVD為21.6(19.72±5.11)個微淋巴管/100倍視野，且瘤周組織LMVD顯著高于瘤內(p=0.000)。按照乳腺癌腋淋巴結轉移數(shù)目分層分析，腋淋巴結轉移數(shù)目和瘤周區(qū)域組織D2-40標記微淋巴管密度相關(P<0.05)，腋淋巴結轉移數(shù)目越多，D2-40陽性的微淋巴管密度越大，而和瘤內區(qū)域D2-40標記的微淋巴管密度無統(tǒng)計學相關性(p>0

9、.05)。 免疫組化方法半定量檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-A、VEGF-C蛋白主要表達于乳腺癌細胞的胞漿或胞膜及少量間質脈管內皮細胞胞漿，陽性率分別為64.7﹪(66/102)和55.9﹪(57/102)，顯著高于對照組(P<0.05)。VEGF-C mRNA的表達主要位于乳腺癌細胞的胞漿中，陽性率為59.8﹪(61/102)，與其蛋白翻譯水平基本一致。VEGF-A在蛋白質翻譯水平上的表達強度與乳腺癌大小、腋淋巴結轉移數(shù)目和臨床分期有關(

10、P<0.05)，而與患者年齡、組織學分級無明顯相關(P>0.05)：VEGF-C在mRNA轉錄豐度和蛋白質翻譯水平上的表達強度均與乳腺癌乳腺癌大小、腋淋巴結轉移及臨床分期有明顯相關性(P<0.05)。在乳腺癌組織中VEGF-A、VEGF-C的免疫組化表達強度及VEGF-CmRNA轉錄豐度與C-erbB-2、P53的表達強度相關(P<0.05)。 VEGF-C在蛋白及mRNA水平上的表達均與D2-40標記淋巴管密度有顯著相關性(P

11、<0.05)，隨著VEGF-CmRNA轉錄豐度和VEGF-C蛋白質表達豐度的增高，陽性淋巴管密度也逐漸增加，腫瘤周圍管腔擴張的功能型微淋巴管密度增加更明顯(P<0.05)。VEGF-A陽性組也可見D2-40標記陽性微淋巴管表達，但淋巴管數(shù)目較少，尚不能進行統(tǒng)計學分析。結論：在人乳腺癌中，新近發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體D2-40標記的瘤周微淋巴管密度與乳腺癌腋淋巴結轉移數(shù)目相關(P<0.05)，其有望成為人乳腺癌組織微淋巴管內皮細胞的特異性標記物。

12、對血管內皮細胞生長因子的半定量分析發(fā)現(xiàn)人乳腺癌中VEGF-C的mRNA轉錄豐度與其蛋白質翻譯水平相大致相同(59.8﹪和55.9﹪)，且統(tǒng)計學分析顯示VEGF-A蛋白表達率、VEGF-C蛋白表達率及mRNA轉錄豐度與乳腺癌腫塊大小、腋淋巴結轉移情況、臨床分期等與乳腺癌預后相關的臨床病理因素有統(tǒng)計學相關性(P<0.05)，這表明VEGF家族可能參與了腫瘤的擴散轉移，并有望成為一個判斷乳腺癌預后的生物學指標。對比C-erbB-2、P53與V