人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和功能.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)是近年發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于中胚層的一類非造血成體干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的共性：高度自我更新和多向分化能力。由于其具有低免疫原性、促進(jìn)造血重建、免疫調(diào)節(jié)等特性，成為一類理想的移植備選干細(xì)胞。MSC的免疫調(diào)節(jié)是目前移植領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)，但其作用機(jī)制目前尚不十分明確。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的一類抗原呈遞細(xì)胞，它可以激活初始型T淋巴細(xì)胞(naiveT

2、cells)，是免疫應(yīng)答的始動(dòng)因素，在免疫應(yīng)答中處于重要的地位。DC對(duì)造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)的發(fā)生及耐受中起著雙向調(diào)節(jié)作用，研究間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)DC的作用機(jī)制對(duì)移植免疫有重大意義，將為防治異基因造血干細(xì)胞移植中移植物抗宿主病提供可能途徑。國(guó)內(nèi)外研究集中在間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)DC亞群、成熟程度及分泌細(xì)胞因子的影響，其機(jī)制仍有爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)旨在研究間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)DC成熟程度及分

3、泌細(xì)胞因子的影響，進(jìn)而探討間充質(zhì)干細(xì)胞防治GVHD的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。 材料和方法： 1.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 取健康成人骨髓，以密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用含15％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，取第5代細(xì)胞以FITC標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45單克隆抗體流式細(xì)胞儀鑒定表型。 2.單核細(xì)胞來(lái)源的人樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定 取健康成人外周血Fi

4、coll密度梯度離心法收獲單個(gè)核細(xì)胞，用含10％胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育兩小時(shí)后棄去非貼壁細(xì)胞，加含IL-4(10ng/ml)、GM-CSF(10ng/ml)的10％胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，部分細(xì)胞第5天加入LPS(100ng/ml)、TNF-a(10ng/ml)促其成熟，第7天收獲懸浮細(xì)胞。以FITC、PE標(biāo)記的鼠抗人CD1a、CD80、CD83、HLA-DR單克隆抗體流式細(xì)胞

5、儀鑒定第5天、第7天DC免疫表型。 3.樹(shù)突狀細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定表型變化 部分培養(yǎng)第5天的細(xì)胞收獲后，以每孔1×106密度種于24孔培養(yǎng)板，分為單獨(dú)培養(yǎng)組和混合培養(yǎng)組，加LPS(100ng/ml)、TNF-a(10ng/ml)促DC成熟，混合培養(yǎng)組另加入等體積3-6代MSC上清混合培養(yǎng)，48小時(shí)后收獲DC鑒定表型。 4.IL-10、IL-12濃度測(cè)定 分別取3-6代MSC上清、單獨(dú)培養(yǎng)組第7天DC上清、混

6、合培養(yǎng)組第7天DC上清，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，ELISA試劑盒分別測(cè)定其IL-10、IL-12濃度。 5.四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)測(cè)定刺激淋巴細(xì)胞反應(yīng) 將異基因淋巴細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞置于96孔板，收獲單獨(dú)培養(yǎng)組第7天DC、混合培養(yǎng)組第7天DC，分別以1∶40、1∶20、1∶10的比例加入單獨(dú)培養(yǎng)組DC和混合培養(yǎng)組DC，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)，終止前4小時(shí)加入MTT。 6.所

7、得結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s表示)。兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.MSC的鑒定：取培養(yǎng)至第5代MSC，流式細(xì)胞儀鑒定表型，表達(dá)CD29、CD44，不表達(dá)CD34、CD45造血干祖細(xì)胞標(biāo)記，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)特性證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.DC的鑒定：從外周血獲取的PBMC貼壁兩小時(shí)后，獲得的貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞，培

8、養(yǎng)第2天細(xì)胞開(kāi)始變形，第3天有部分細(xì)胞開(kāi)始懸浮，第7天大部分細(xì)胞懸浮不貼壁，懸浮細(xì)胞有樹(shù)突狀突起呈星形或幕形，流式細(xì)胞儀鑒定表型，第五天DC高HLA-DR，低表達(dá)CD1a、CD80、CD83，第7天DCCD1a、CD80、CD83表達(dá)明顯升高，經(jīng)TNF-a、LPS刺激大量分泌IL-12，能顯著刺激異基因淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。 3.MSC上清作用后DC免疫表型的變化：與3-6代間充質(zhì)干細(xì)胞上清等體積作用48小時(shí)，加LPS(100ng/

9、ml)、TNF-a(10ng/ml)刺激成熟，與成熟樹(shù)突狀細(xì)胞相比，CD1a、CD80、CD83表達(dá)明顯降低，HLA-DR無(wú)明顯變化，免疫表型符合不成熟DC。 4.IL-10、IL-12濃度測(cè)定：3-6代MSC上清ELISA法測(cè)定不分泌IL-10、IL-12，成熟DC大量分泌IL-12(356.25±24.24pg/ml)，IL-10未測(cè)到，與MSC上清混合培養(yǎng)的DC分泌IL-12明顯減低(207.5±13.63pg/ml)，減

10、少41.7％(p＜0.05)，IL-10未有變化。 5.刺激淋巴細(xì)胞反應(yīng)：成熟DC具有很強(qiáng)的刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力，且與DC數(shù)量成線性關(guān)系，而混合培養(yǎng)DC刺激能力明顯降低，單獨(dú)培養(yǎng)組DC和混合培養(yǎng)組DC在1∶40、1∶20、1∶10三個(gè)比例組均有顯著性差異(p＜0.05)。 結(jié)論 1.建立了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，為間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了可行條件。 2.間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清抑