Wnt-β-catenin信號通路在氯化鎘誘導HEK 293細胞增殖興奮效應中的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　研究Wnt/β-catenin信號通路在氯化鎘誘導HEK293細胞增殖的毒物興奮效應中的作用,探討氯化鎘所致細胞增殖興奮效應的機制,為進一步理解毒物興奮效應及其安全性提供參考。
　　研究方法與研究內(nèi)容:
　　1.針對β-catenin基因序列設計并合成三對 shRNA,構(gòu)建shRNA質(zhì)粒載體,干擾HEK293細胞β-catenin基因mRNA表達,阻斷細胞Wnt/β-catenin信號通路。
　　

2、2.CCK-8法檢測不同劑量氯化鎘對 HEK293細胞增殖的影響,建立氯化鎘所致 HEK293細胞增殖興奮效應模型,并確定毒物興奮效應劑量范圍(Hormetic Zone)。
　　3.CCK-8法檢測不同劑量氯化鎘對β-catenin基因干擾 HEK293細胞增殖的影響,探討Wnt/β-catenin信號通路在氯化鎘所致細胞增殖興奮效應中的作用。
　　4.實時熒光定量 PCR法檢測不同劑量氯化鎘作用于 HEK293細胞與β-

3、catenin基因干擾HEK293細胞24h后Cyclin D1、c-myc基因的表達水平。
　　5.流式細胞術(shù)檢測不同劑量氯化鎘作用于HEK293細胞與β-catenin基因干擾的HEK293細胞24h后細胞周期的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.構(gòu)建出含三個目的基因干擾序列的shRNA質(zhì)粒載體,利用RT-PCR和Western Blot篩選出一個有效的shRNA質(zhì)粒載體,其對β-catenin基因mRNA表達抑制率為

4、67.68％、蛋白表達抑制率為61.27%。
　　2.氯化鎘作用于HEK293細胞24h,0.1μmol/L~1μmol/L劑量組的細胞相對增殖率高于空白對照組,表現(xiàn)出細胞增殖的homersis效應。氯化鎘作用于 HEK293細胞48h,0.001μmol/L~0.5μmol/L劑量組細胞相對增殖率高于空白對照,表現(xiàn)出細胞增殖的homersis效應。
　　3.氯化鎘作用于β-catenin基因干擾HEK293細胞24h,只有

5、0.5μmol/L劑量組細胞相對增殖率高于空白對照,表現(xiàn)出細胞增殖的homersis效應;低劑量氯化鎘作用于β-catenin基因干擾的HEK293細胞48h后,沒有出現(xiàn)細胞增殖的homersis效應。
　　4.熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯化鎘作用于HEK293細胞24h,0.01μmol/L~1μmol/L劑量組細胞 Cyclin D1基因相對表達量升高,與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Cyclin D1表達量呈現(xiàn)先升

6、高后降低趨勢,在1μmol/L氯化鎘作用下Cyclin D1表達水平達到最高值。氯化鎘作用于β-catenin基因干擾HEK293細胞24h,各劑量組Cyclin D1表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　5.熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯化鎘作用于HEK293細胞24h,0.1μmol/L~10μmol/L劑量組細胞 c-myc基因相對表達量升高,與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),氯化鎘劑量與 c-m

7、yc表達量呈現(xiàn)線性劑量-反應關(guān)系,在10μmol/L氯化鎘作用下 c-myc表達水平達到最高值。氯化鎘作用于β-catenin基因干擾HEK293細胞24h,10μmol/L劑量組 c-myc表達水平升高,與對照組比較差異統(tǒng)計學意義（P<0.05),0.01μmol/L~1μmol/L劑量組 c-myc表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05)。
　　6.細胞周期分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯化鎘作用于HEK293細胞24h后,0.1

8、μmol/L、1μmol/L劑量組 G1期細胞百分比低于空白對照組(P<0.05),1μmol/L劑量組 S期細胞百分比高于空白對照組(P<0.05),而0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L劑量氯化鎘作用于β-catenin基因干擾HEK293細胞24h后,各劑量組細胞G1和S期百分比與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.低劑量氯化鎘能誘導 HEK293細胞產(chǎn)生細胞增殖