不同填充材料及脂肪源干細胞移植對骨質疏松大鼠的影響.pdf

1、背景：
　　 骨質疏松主要的特征是骨量減少和骨微結構破壞，導致骨脆性增加同時易于骨折的代謝性疾病。隨著老齡化社會的發(fā)展，骨質疏松患者不斷增多，如何有效預防和治療骨質疏松已經成為國內外的熱門話題。根據(jù)原林教授提出的“筋膜學說”:人體可以看做是由尚未分化的非特異性結締組織（筋膜）支架構成的支持與儲備系統(tǒng)與被該支架支持與包繞的已分化為各種功能細胞構成的功能系統(tǒng)共同組成。建立在各種功能細胞的專能特化的基礎上的功能系統(tǒng)是被以筋膜支架中未分

2、化的干細胞為核心的支持與儲備系統(tǒng)支持和包繞的。支持與儲備系統(tǒng)內未分化干細胞在微環(huán)境下通過分化為各種定向干細胞，源源不斷的為功能系統(tǒng)中各種功能細胞的更新提供細胞源泉，同時為功能系統(tǒng)中的各種功能細胞的代謝提供營養(yǎng)，維持其內環(huán)境的穩(wěn)定。因此，在支持與儲備系統(tǒng)的支持下功能系統(tǒng)才可能維持結構和功能的穩(wěn)定，當某種功能細胞在代謝過程中不能及時得到新細胞的補充，出現(xiàn)代謝障礙，機體就可能會出現(xiàn)相應的病變。骨質疏松的發(fā)病機制正是在骨組織吸收后，筋膜結締組織

3、支架中未分化的干細胞未能充分向成骨細胞分化，造成骨形成不足而出現(xiàn)的一種疾病。因此，如何干預骨代謝過程中出現(xiàn)的負平衡，如何有效保證并增加筋膜結締組織支架中未分化的干細胞，使成骨細胞得到有效的補充，促進骨的形成，重建骨的正平衡是治療骨質疏松的關鍵。
　　 目前，骨缺損的修復仍是骨科臨床中的棘手難題之一，以往研究顯示采用骨移植治療骨缺損的方法取得了一定的效果，但此方法存在較大的局限性。自體骨移植一直以來都被認為是骨缺損修復的一個金標準

4、，由于植取骨量有限，已形成供區(qū)畸形，取骨手術也同樣增加了患者的創(chuàng)傷痛苦;異體骨移植雖然取材方便，易獲取，可減少手術次數(shù)，但是由于其具有抗原性，可引起機體的免疫排斥反應，同時存在著潛在傳播疾病的風險，故異體骨移植的并發(fā)癥也較多，如感染、骨折、骨不愈合等等。因此，人們對新型移植替代物的需求也不斷增加。目前各種骨水泥已經備受青睞。伴隨人口老齡化的發(fā)展，骨質疏松癥已成為威脅著中老年人健康的主要疾病。骨質疏松極易并發(fā)骨折，同時這骨折也常伴有松質骨

5、壓縮及骨缺損。伴隨著骨質疏松絕對人口的增加，因各種原因引起的骨缺損合并骨質疏松的患者也逐年增加。當機體骨質疏松時，由于破骨細胞活性增強，骨的吸收大于骨的形成，故新骨生成能力下降，導致骨質疏松骨缺損的愈合時間明顯延遲，而新生骨痂減少，愈合后的骨生物力學強度差，容易骨折。與常規(guī)骨缺損的治療相比，治療骨質疏松骨缺損的花費要更大且傳統(tǒng)方法療效欠佳。骨水泥已逐漸被應用到骨質疏松骨折骨缺損的輔助治療中，它一方面可增強固定螺釘，防止骨質疏松骨折內固定

6、的松動，另一方面填充骨折的缺損，使其復位及愈合更好，減少發(fā)生骨折后遺癥。磷酸鈣骨水泥近幾年也被應用于椎體成形術來治療骨質疏松椎體壓縮骨折，且療效良好。緩釋性骨長因子也漸漸被應用于骨質疏松骨缺損的治療中，這顯著加速了骨缺損的愈合，還在一定程度上改善局部的骨質疏松，增強局部骨生物力學，降低骨折的發(fā)生幾率。
　　 脂肪組織同樣也是兩系統(tǒng)理論中的支持與儲備系統(tǒng)中重要組成部分，其分離出的脂肪源干細胞(adipose-derived ste

7、m cells，ADSCs)是筋膜結締組織支架中未分化干細胞的一種重要儲備形式。脂肪源干細胞的研究逐漸成為干細胞研究的熱點。脂肪源干細胞易于獲取，便于分離培養(yǎng);具有多向分化潛能，能跨胚層分化為三胚層內的組織細胞，在特定的環(huán)境中可以向成骨、成軟骨、成脂、成肌和成神經等誘導分化;具有免疫原性低和調節(jié)免疫功能。此外，骨髓間充質干細胞相比，脂肪源干細胞來源更廣泛，獲取更容易，對于病人而言，帶來的創(chuàng)傷和痛苦更小。這些特征為脂肪源干細胞的同體及異體

8、移植提供了更有利條件。因此，通過增加機體筋膜結締組織內的未分化的脂肪源干細胞，促進其成骨分化，增加骨形成，可能會對骨質疏松起到預防和治療作用。
　　 利用糖皮質激素建立骨質疏松模型是目前國際上比較公認的骨質疏松癥藥物模型。長期注射大劑量的糖皮質激素可引起體內鈣磷代謝的紊亂，促進甲狀旁腺素的分泌，抑制骨保護素的分泌，抑制成骨細胞增殖和活性，增加破骨細胞數(shù)量和活性等多種途徑促使骨形成減少，骨吸收增加，從而導致骨質疏松的發(fā)生。

9、　　 為了探討異體脂肪源干細胞移植及不同骨填充材料對骨質疏松的預防和治療作用，本實驗通過觀察異體脂肪源干細胞移植對糖皮質激素致骨質疏松大鼠體內血清鈣及磷代謝、骨密度、骨生物力學及骨組織形態(tài)計量學等方面的影響進行綜合評價，同時通過觀察不同填充材料對去卵巢骨質疏松大鼠的骨切片的影響，探索一種新的骨質疏松治療方法，為臨床骨質疏松的預防和治療提供新的研究思路。
　　 目的：
　　 1、體外分離培養(yǎng)腹股溝皮下脂肪源干細胞，并對其

10、進行多向分化能力和表面標志的鑒定，以判斷在支持與儲備系統(tǒng)中是否存在未分化的脂肪源干細胞;
　　 2、通過對骨密度檢測，判斷長期給予糖皮質激素是否成功模擬建立骨質疏松模型？
　　 3、通過檢測大鼠鈣、磷、堿性磷酸酶，觀察異體脂肪源干細胞移植對糖皮質激素致骨質疏松大鼠的骨體內鈣、磷代謝和骨形成的影響;
　　 4、通過檢測實驗大鼠的骨密度，觀察異體脂肪源干細胞對糖皮質激素致骨質疏松大鼠骨質量的影響;
　　 5、

11、通過檢測三點彎曲試驗，觀察移植異體脂肪源干細胞對糖皮質激素致骨質疏松大鼠的骨強度和骨剛度的影響;
　　 6、通過對骨組織形態(tài)計量學觀察，探索異體脂肪源干細胞移植對糖皮質激素致骨質疏松大鼠骨組織微環(huán)境的影響;
　　 7、為進一步證實“筋膜學說”中“通過動員支持與儲備系統(tǒng)中未分化干細胞可以治療退行性和衰老性疾病”提供部分實驗依據(jù)。
　　 8、通過不同骨填充材料對去卵巢大鼠進行填充后進行相應骨形態(tài)學觀察，篩選最佳骨材料

12、，為臨床新材料的應用提供部分依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、取成年SD大鼠腹股溝皮下脂肪墊，Ⅰ型膠原酶消化，體外分離培養(yǎng)筋膜結締組織中脂肪源干細胞。分別通過形態(tài)學、成脂成骨誘導分化及利用流式細胞術對表面抗原CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106進行鑒定4代脂肪源干細胞，判斷所培養(yǎng)的細胞是否為具有多向分化潛能的脂肪源干細胞。
　　 2、40只SD雌性大鼠隨機分成空白對照組（A組）、模型組（

13、B組）、治療組(C)和治療對照組（D組）。B、C和D組分別給予頸背部皮下注射醋酸潑尼松龍注射液8mg/kg，3次/周;A組給予頸背部皮下注射生理鹽水0.8mL，3次/周。12周后，將A組和B組處死取材，判斷造模是否成功。
　　 3、模擬骨質疏松模型成功后，收集傳至第4代的脂肪源干細胞，經尾靜脈向C組大鼠每只注射脂肪源干細胞3×106個，D組大鼠每只注射1mL生理鹽水，4周后處死取材。
　　 4、應用水合氯醛麻醉大鼠后，用

14、促凝管接取心臟血液，室溫下放置8h后3000r/min，離心15min后制備血清，分裝后-70℃保存。全自動生化分析儀分別利用偶氮砷Ⅲ法、磷鉬酸比色法及速率法測定血清中鈣、磷和堿性磷酸酶的含量。取血完畢后，采用心臟放血處死，分別取出大鼠雙側股骨和第三至第五腰椎，去除周圍肌肉組織。利用雙能X線骨密度儀小動物測量軟件測定腰椎和右側股骨的骨密度值。利用BOSE生物材料動態(tài)力學試驗機對左側股骨進行三點彎曲實驗，股骨背側向上，腹側向下，跨距為18

15、mm，速率為0.05mm/s，股骨壓斷時記錄最大載荷和剛度值。
　　 5、處死大鼠后取出右側脛骨上1/3部分，手術刀片矢狀面剖開，固定后酒精逐級脫水，分別浸入浸液Ⅰ（甲基丙烯酸甲酯70mL+鄰苯二甲酸二丁酯30mL）、浸液Ⅱ（浸液Ⅰ+過氧化苯甲酰1g）和浸液Ⅲ（浸液Ⅰ+過氧化苯甲酰2.5g）各2d，再用新鮮配制的浸液Ⅲ進行包埋。Jung K重型切骨機連續(xù)切取6μm厚度切片，分別進行組織學觀察（Gemisa染色）和類骨質觀察（vo

16、n Kossa染色）。測量區(qū)域為生長板下1mm至4mm范圍內，采用Lecia QWin多功能彩色病理圖像分析軟件進行骨組織形態(tài)計量學分析。具體參數(shù)包括骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)和單位骨小梁破骨細胞數(shù)(OC.N)，均采用國際通用的公式進行計算。
　　 6、骨質疏松模型手術:正常雌性大鼠全麻成功后，腹部剃毛，碘伏消毒。下腹正中切口，逐層進入腹腔。找出一側

17、卵巢結扎切除。同法切除另一側?？p合腹膜及腹肌，最后縫合皮膚。一周拆線。3個月后即為骨質疏松模型。
　　 7、待模型建立成功后，做材垂直骨面鉆孔深5毫米建立骨隧道。于隧道內植入材料并輕輕壓實至骨面，然后用骨蠟封堵料植入手術:全麻成功后雙下肢膝周前內側剃毛。碘伏消毒。從膝部沿脛骨前棘切口長約2cm。逐層進達骨膜下，骨膜下剝離顯露脛骨近端前內側面，用直徑3毫米鉆頭。止血，沖洗，選取四種生物材料:β-磷酸三鈣(β-TCP);硅酸鈣(CS

18、)，降解后，釋放有益元素硅;摻鍶硅酸鈣(Sr-CS)，降解后，釋放有益元素硅、鍶;45s5生化陶瓷玻璃進行填充骨缺損。縫合傷口。9周后處死取材。
　　 8、應用HE染色、Giemsa、T-blue、Van gieson、番紅O&固綠進行染色。觀察不同填充材料骨切片形態(tài)學變化。
　　 結果：
　　 1、經光學顯微鏡觀察，原代培養(yǎng)的ADSCs在24h后大部分可貼壁，細胞呈梭形、圓形、多邊形等。細胞長勢良好，7d后可以

19、1∶3比例傳代，之后每3d傳一次代。經換液傳代至第4代，可見細胞形態(tài)均一，呈紡錘形或者多角形。體外可以向成脂、成骨誘導分化。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)CD29和CD90呈強陽性，CD106呈弱陽性，CD11b、CD45和CD49d呈陰性。
　　 2、長期大劑量給予糖皮質激素后，與空白對照組大鼠血清鈣（3.63±0.20）、血清磷水平（3.12±0.83）和堿性磷酸酶水平（203.8±40.36）、腰椎骨密度（162.70±14.77）、

20、股骨骨密度（254.40±28.95）、骨強度(98.22±10.72)和骨剛度（192.66±42.28）比較，模型組大鼠血清鈣（2.60±0.18）和堿性磷酸酶水平（149.50±22.21）、腰椎骨密度（115.70±16.87）、股骨骨密度（183.40±12.28）、骨強度（58.88±12.53）和骨剛度（127.53±19.13）均顯著降低，而血清磷水平(5.25±1.11)顯著上升（P＜0.05）;骨小梁變細、變薄，骨小

21、梁排列紊亂，骨小梁間出現(xiàn)斷裂，間距增大，出現(xiàn)陷窩;骨小梁的數(shù)量（4.95±0.75）、相對體積(17.31±3.66)和厚度（35.82±3.88）均顯著降低(P＜0.05)，而骨小梁的分離度(171.30±29.72)增高，單位骨小梁破骨細胞數(shù)（52.70±10.34）增多（P＜0.05）。
　　 3、異體移植脂肪源干細胞后，與模型組比較，治療組大鼠血清鈣（3.01±0.30）和堿性磷酸酶水平（202.5±40.82）、股骨骨

22、密度（226.50±25.54）、（腰椎骨密度149.30±12.52）、骨強度（80.37±9.37）和骨剛度（187.10±30.06）均顯著增加，而血清磷水平（2.84±1.78）顯著降低（P＜0.05）;骨小梁數(shù)目增多，骨小梁變厚變粗，骨小梁間出現(xiàn)連接，陷窩減少;骨小梁的數(shù)量（6.42±1.24）、相當體積(25.00±4.88)和厚度（39.63±4.16）顯著增加，而骨小梁分離度(124.72±29.79)顯著降低，單位骨小

23、梁破骨細胞數(shù)（29.52±8.38）減少（P＜0.05）。
　　 4、各種染色結果顯示β-磷酸三鈣組9w無炎癥反應;而CS硅酸鈣和Sr-CS摻鍶硅酸鈣:相對TCP有較多的成骨，但9w仍有炎癥反應。
　　 結論：
　　 1、兩系統(tǒng)理論中的支持與儲備系統(tǒng)中含有脂肪源干細胞，并且這種干細胞是一種未分化的間充質干細胞;
　　 2、長期給予大劑量的糖皮質激素可以模擬骨質疏松模型;
　　 3、通過移植異體脂肪

24、源干細胞可有效改善體內鈣、磷代謝，增加骨形成，有效預防和治療骨質疏松，為臨床上骨質疏松的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法;
　　 4、對“筋膜學說”中“通過動員筋膜結締組織中儲備的未分化干細胞可治療退行性疾病”提供了部分實驗依據(jù)。
　　 5、不同的骨填充材料，對骨創(chuàng)傷面影響不同。新材料CS和Sr均可促進骨形成。為臨床上骨質疏松的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法。
　　 綜上所述，移植異體脂肪源干細胞對

25、糖皮質激素致骨質疏松大鼠有一定的治療及預防作用，能夠促進骨形成，增加骨密度，改善骨生物力學性能，增強骨強度，降低骨折的發(fā)生率。本實驗進一步提示在骨質疏松的研究中應該更加關注提高機體干細胞的數(shù)量和促進干細胞向成骨細胞分化及骨組織的形成方面，為臨床上治療骨質疏松提供了一種新的研究思路。同時，不同填充骨質疏松骨缺損的新材料填充后骨切片對比，新材料CS和Sr均可促進骨形成。為臨床上骨質疏松的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法。