MCL-1反義寡核苷酸對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞多藥耐藥性影響的研究.pdf

1、目的：惡性黑素瘤是最具危險(xiǎn)性的一種皮膚腫瘤，多藥耐藥是其臨床治療失敗的主要原因，化療藥物的主要作用之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而抗凋亡基因的過(guò)度表達(dá)使化療藥物不能發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡的作用，致使惡性黑素瘤臨床治療反應(yīng)不佳預(yù)后差，死亡率居高不下。BCL-2基因家族起調(diào)節(jié)凋亡的作用，其家族成員在結(jié)構(gòu)上具有同源性，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目前已確定了至少15名成員。雖然結(jié)構(gòu)相似，但在功能上卻可分為促凋亡的基因和抑制凋亡的基因。Mcl-1基因又稱髓樣細(xì)胞白血病-1

2、(Mcl-1)，是BCL-2家族中的一員，功能上屬于抗凋亡的BCL-2亞家族。反義技術(shù)因其高效、特異、合成簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，正逐漸成為人們研究腫瘤發(fā)病機(jī)制及基因治療腫瘤等的重要研究方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體輔助轉(zhuǎn)染MCL-1反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)，同時(shí)聯(lián)合作用化療藥物，以觀察抑制抗凋亡基因的表達(dá)對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞化療耐藥性的影響。 方法：培養(yǎng)惡性黑素瘤細(xì)胞WM45l，在陽(yáng)離子

3、脂質(zhì)體的輔助下轉(zhuǎn)染MCL-1的反義寡核苷酸利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)的方法觀察轉(zhuǎn)染前后MCL-1基因表達(dá)情況；免疫組化及WesternBlot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后MCL-1的蛋白表達(dá)情況。電鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后凋亡細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡率。MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性及IC50的變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染MCL-1

4、AS-ODN后2小時(shí)，mRNA的表達(dá)減少75﹪，轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，蛋白的表達(dá)減少了62﹪。轉(zhuǎn)染MCL-1AS-ODN后，電鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示ASODN組細(xì)胞早期凋亡率(13.6﹪)為對(duì)照組(6.3﹪)2倍，正義組(7.3﹪)和無(wú)義組(5.26﹪)對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響(P＞0.05)。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義核酸組DTIC的IC50值(92.63±¨.54/L)較對(duì)照組(152.74±33.08mg/L)顯著降