金黃色葡萄球菌saeRS和agr對其分泌蛋白及毒力的影響.pdf

1、目的：金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，可以引起許多臨床表現不同的感染性疾病。它所致感染的多樣性和嚴重度取決于不同毒力因子的協(xié)同表達，而這些數量眾多的毒力因子的表達會受到不同調節(jié)系統(tǒng)的控制，同時這些調節(jié)系統(tǒng)之間也存在著復雜的相互作用關系。金黃色葡萄球菌可以產生多種毒力因子，其中殺白細胞素(Panton-Valentine Leukocidin，PVL)是社區(qū)獲得性金黃色葡萄球菌(community-acquired MRSA，CA-

2、MRSA)的重要毒力因子，PVL的致病作用近些年受到廣泛關注。金黃色葡萄球中的葡萄球菌附屬基因調節(jié)子(accessory generegulator, agr)和SaeRS(Staphylococcus aureus exoprotein expression)雙組分信號轉導系統(tǒng)，在調節(jié)金黃色葡萄球菌毒力因子的協(xié)同表達上起著重要作用。為了深入研究agr系統(tǒng)和SaeRS雙組分信號轉導系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌分泌蛋白及毒力的影響，我們在前期成功

3、構建的一株臨床分離金黃色葡萄球菌的agr缺失突變株的基礎上，又利用同源重組技術，構建了saeRS敲除突變株及saeRS、agr雙敲除突變株，并對其相關功能做了初步研究。
　　 方法：用PCR擴增金黃色葡萄球菌SA75的saeRS基因上下游同源臂，構建同源重組質粒pKOR1-△saeRS，將質粒電轉入金黃色葡萄球菌RN4220中進行修飾，再電轉入金黃色葡萄球菌和agr基因敲除突變株中。將含有重組質粒的金黃色葡萄球菌和agr基因敲除

4、突變株經一系列變溫傳代培養(yǎng)，使用脫水四環(huán)素篩選saeRS缺失可疑突變株，對篩選到的可疑突變株用PCR和基因測序進行確認。確認構建成功后，使用Triton X-100檢測野生株和突變株間的自溶能力，應用SDS-PAGE檢測基因敲除前后金黃色葡萄球菌(SA75)分泌蛋白的變化，使用血平板法檢測野生株和基因敲除株間溶血能力的改變，使用RT-PCR檢測saeRS及agr基因對金黃色萄球菌(SA75)hla、hlb、luks-PV和spa基因表達

5、的影響。
　　 結果：金黃色葡萄球菌于2010年2月分離自溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院一皮膚軟組織化膿性感染患者的膿液標本，經革蘭染色、血漿凝固酶實驗及全自動微生物分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌。經PCR證實agr、saeRS基因陽性，lukS-PV基因陽性;將saeRS基因上游片斷的PCR產物(1000bp)、saeRS基因下游片斷的PCR產物(1000bp)兩者連接后插入質粒pKOR1，成功構建pKOR1-△saeRS。同源重組質粒p

6、KOR1-△saeRS先被電轉入金黃色葡萄球菌RN4220進行修飾，然后再電轉入金黃色葡萄球菌SA75和SA75△agr基因敲除突變株中。提高已轉入pKOR1-△saeRS的金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)溫度(42℃)，之后降溫進行培養(yǎng)(30℃)，促進同源重組的發(fā)生，利用脫水四環(huán)素的誘導凋亡進行篩選，獲得疑似突變株。在saeRS基因上游片段的上游和下游片段的下游各設計一條引物，以突變株的染色體基因組DNA為模板進行擴增，得到的片段比野生株SA75

7、基因組DNA為模板擴增得到的片段要少1724 bp。將擴增得到的產物進行測序分析，確認敲除突變株構建成功。在構建完各突變株后，我們分析了SA75株和突變株SA75△saeRS、SA75△agr和SA75△saeRS△agr在生長曲線、自溶能力、生化特性、分泌蛋白、溶血能力和蛋白水解能力等方面的差異。發(fā)現和SA75相比，各基因敲除突變株的生長，自溶能力和生化特性并無別大的差異，僅SA75△agr和SA75△saeRS△agr在平臺后期生長

8、有所增快，在生化特性上SA75△agr和SA75△saeRS△agr基因敲除株有較大的改變。在分泌蛋白上，我們發(fā)現和野生株相比，各突變株分泌蛋白的量和種類都有明顯的減少，尤其是SA75△saeRS△agr株，說明saeRS和agr是調控金黃色葡萄球菌外分泌蛋白的重要因子，但是就其具體調控哪些分泌蛋白還需要進一步的研究。在溶血能力的檢測上，我們發(fā)現與野生株SA75相比，各基因敲除突變株溶血圈的直徑明顯減小，溶血圈也沒有野生株那么透明，而S

9、A75△saeRS△agr未見有溶血圈的產生。說明saeRS和agr也是調控金黃色葡萄球菌溶血毒素表達的重要調控因子。在水解蛋白能力上，我們發(fā)現SA75△saeRS和野生株SA75沒有發(fā)現蛋白水解圈的產生，而SA75△agr和SA75△saeRS△agr在孵育了6h后發(fā)現有明顯的蛋白水解圈的產生，且其水解圈直徑相當。說明在金黃色葡萄球菌中agr基因缺失后，其蛋白水解能力增強。通過RT-PCR技術，我們發(fā)現在敲除突變株中一些毒力因子基因，