抗氧化劑對間歇低氧致大鼠胰腺組織氧化損傷的保護作用.pdf

1、前言：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種累積多系統(tǒng)和造成多器官損害的常見睡眠呼吸疾病。流行病學、臨床及實驗室研究證實，OSAS是2型糖尿病的獨立危險因素[1，2]，且其作用獨立于肥胖、糖尿病家族史及年齡等混淆因素[3]。
　　OSAS患者在睡眠過程中，由于上氣道反復塌陷，發(fā)生十分嚴重的反復窒息，導致OSAS的特征性低氧方式-間歇低氧(interm

2、ittent hypoxia，IH)，使患者整夜交替暴露于低氧張力(IH過程)和正常氧張力(即再氧合過程，reoxygenation，ROX)。間歇低氧的反復發(fā)生，會出現(xiàn)類似于缺血/再灌注過程中所出現(xiàn)的病理改變，產(chǎn)生過多的ROS，從而啟動機體氧化應激[4]，因此目前OSAS被認為是一種氧化應激性疾病[5]。
　　氧化應激同樣在內(nèi)分泌疾病研究領(lǐng)域已被證實是胰島素抵抗、β細胞功能障礙和觸發(fā)糖尿病的一個重要機制[6，7]。胰島素抵抗和胰

3、島β細胞功能紊亂是2型糖尿病最主要的兩個病理生理缺陷，近幾年的研究證實間歇低氧單因素即可以引起胰島素抵抗且不依賴于自主神經(jīng)系統(tǒng)的興奮及肥胖因素的影響[8]，但間歇低氧對胰島β細胞功能的影響很少涉及，而后者與胰島素抵抗一樣，是糖尿病發(fā)病中不可或缺的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)胰島β細胞內(nèi)抗氧化酶系含量較其他細胞少[9]，而細胞對自由基損傷的易感性取決于細胞內(nèi)抗氧化酶系的含量[10]，因而β細胞較其他細胞對氧化應激更為敏感，體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除障

4、礙更易導致β細胞損傷及糖尿病的發(fā)生[11，12]，因此我們依此對間歇低氧條件下的胰島β細胞進行研究。
　　目前，有許多抗氧化劑被研究并報道可減弱機體氧化損傷。褪黑素(MelatoninMT)是哺乳動物松果腺合成與分泌的主要激素之一，在生理及藥理濃度均具有抗氧化的作用，并具有清除活性氧的能力，最近報道顯示，褪黑素可以在體內(nèi)外均影響胰島素的分泌，減弱糖尿病的代謝紊亂和氧化應激狀態(tài)[13];近年亦有MT與間歇低氧之間的研究，它可通過增加

5、抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄[14]及減少β-淀粉肽的產(chǎn)生[15]以減弱間歇低氧對大鼠海馬的損傷;并可減輕間歇低氧誘導的微血管損傷及胰島素抵抗[16]。
　　本實驗目的:(1)通過建立間歇低氧大鼠模型，觀察間歇低氧對大鼠胰腺組織的影響，給予褪黑素干預觀察其對間歇低氧條件下的大鼠的胰腺組織的保護作用;(2)體外培養(yǎng)大鼠β細胞系INS-1細胞，去除體內(nèi)的其它影響因素，觀察間歇低氧條件直接作用于細胞引起的細胞功能的改變，以及褪黑素對間歇低氧條件下的I

6、NS-1細胞的保護作用。
　　方法：
　　1、體內(nèi)實驗:
　　28只雄性Sprague-Dawley(S-D)SPF級大鼠隨機平均分為四組:常氧對照組（CON組）、間歇低氧組（IH組）、褪黑素干預組(MT組)和N-乙酰半胱氨酸干預組(NAC組)。常氧對照組于空氣條件下飼養(yǎng)4周，余各組于間歇低氧設備內(nèi)暴露8小時/天，4周;其中MT組及NAC組于暴露前30分鐘分別給予MT及NAC干預處理。于0周、1周、2周、4周檢測各組大

7、鼠空腹血糖，暴露4周后檢測各組大鼠血清胰島素水平的變化;血清、胰腺組織勻漿中的氧化應激指標;實時熒光定量PCR法檢測胰腺組織JNK1、PDX-1mRNA水平;免疫組化法檢測胰腺中JNK1/2蛋白表達;Western Blot半定量分析胰腺組織磷酸化JNK1/2及總JNK1/2、PDX-1蛋白水平。
　　2、體外實驗:
　　(1)間歇低氧條件下作用于大鼠β細胞系-大鼠INS-1細胞3天作為間歇低氧組細胞，常氧組細胞不進行低氧暴

8、露，分別收集暴露不同時間段（1天、2天、3天）的培養(yǎng)上清及細胞，培養(yǎng)上清檢測氧化應激指標，細胞進行實時熒光定量PCR檢測JNK1mRNA表達水平，Western Blot檢測磷酸化JNK1/2、總JNK1/2蛋白表達水平。
　　(2)間歇低氧作用于大鼠INS-1細胞，給予SP600125阻斷JNK蛋白活性，觀察下游基因PDX-1 mRNA及蛋白變化。
　　(3)細胞暴露于間歇低氧條件下，同時給予不同劑量褪黑素干預，觀察褪黑素

9、干預后培養(yǎng)上清氧化應激指標，及磷酸化JNK1/2、總JNK1/2變化。
　　結(jié)果：
　　1、間歇低氧可引起大鼠胰腺組織氧化損傷，抗氧化劑干預治療可改善氧化應激狀態(tài)
　　經(jīng)間歇低氧暴露4周后，IH組血糖從2周開始明顯較其自身0周時增高（7.6±1.5mmol/L VS5.5±0.6mmol/L; P＜0.05），且與CON2w組相比較亦有明顯增高（7.6±1.5mmol/L VS5.9±0.2 mmol/LP＜0.01）

10、;MT2w組低于IH2w組血糖（7.6±1.5mmol/L VS6.2±0.8 mmol/L P＜0.05），MT4w明顯低于IH4w組血糖（7.5±1.5mmol/L VS5.3±0.7mmol/L P＜0.01）。血漿胰島素各組間未見明顯差異(P＞0.05);氧化應激指標顯示IH組血清及組織勻漿MDA較CON組明顯增高(P＜0.01)，MT及NAC可使MDA降低(P＜0.01);IH組血清SOD活力雖然有所下降但與CON組比較無統(tǒng)計

11、學意義，MT可使間歇低氧大鼠血清SOD活力增高，在胰腺組織勻漿中IH組SOD活力明顯降低，低于CON組(P＜0.01)，MT、NAC均可引起SOD活力增強;IH組血清及組織勻漿GSH含量與CON組比較無統(tǒng)計學意義，但褪黑素可明顯提高間歇低氧大鼠GSH水平，與IH組相比較(P＜0.05)。
　　實時熒光定量PCR結(jié)果提示IH組胰腺組織表達JNK1mRNA水平明顯高于CON組、MT組及NAC組(P＜0.01); MT組較IH組表達降低

12、(P＜0.05); MT組與CON組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，NAC組與IH組比較無顯著差異(P＞0.05)，略高于CON組(P＜0.05)。間歇低氧并沒有引起PDX-1mRNA水平明顯下降，IH組與CON組間無顯著性差異（P＞0.05），在褪黑素干預組可見PDX-1mRNA水平明顯升高，但與CON組、IH組及NAC組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　Western Blot分析提示大鼠胰腺組織中總JNK1/2，

13、p-JNK2/t-JNK2各組間均無明顯變化，p-JNK1/t-JNK1結(jié)果顯示，間歇低氧組磷酸化JNK1表達明顯增高，與CON組、MT組、NAC組比較有顯著性差異(P＜0.01)。MT、NAC處理組與CON組相比較無明顯差異(P＞0.05);間歇低氧可引起PDX-1蛋白水平下降（P＜0.01)，褪黑素(P＜0.01)及NAC(P＜0.05)均可逆轉(zhuǎn)由間歇低氧所誘導的PDX-1蛋白下降，且與CON組相比較無明顯差異（P＞0.05）。

14、r>　　免疫組織化學結(jié)果直觀地反映了，正常氧組細胞核內(nèi)棕黃色顆粒少，間歇低氧組可見大量胰島細胞內(nèi)聚積棕黃色顆粒，褪黑素組及NAC組胞核濃染較間歇低氧組減少。
　　2、體外細胞培養(yǎng)提示間歇低氧對大鼠INS-1細胞產(chǎn)生了氧化應激性損傷
　　IH組隨著間歇低氧暴露時間的延長，細胞培養(yǎng)上清液中MDA含量呈進行性增高，1天組與2、3天組間有顯著性差異(P＜0.01)，2天組與3天組間無明顯差異(P＞0.05);不同時程細胞培養(yǎng)上清液S

15、OD活力進行性降低，各組間均有顯著性差異(P＜0.01)。間歇低氧條件下不同時程的細胞表達JNK1mRNA較相應時間CON組明顯增高(P＜0.05)，隨時間變化其表達量進行性下降，IH3d與IH1d組間比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。JNK1/2總蛋白量亦未隨時間延長而增加，而磷酸化JNK1于IH3天組呈現(xiàn)出高表達。
　　3、阻斷磷酸化JNK蛋白活性可改善間歇低氧對PDX-1蛋白的抑制
　　Real Time PCR結(jié)果分

16、析提示間歇低氧可引起PDX-1mRNA下降，給予SP600125阻斷JNK蛋白活性，未能完全扭轉(zhuǎn)PDX-1mRNA表達水平升高到正常組水平。Western Blot對蛋白進行分析呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，IH組PDX-1蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，阻斷JNK蛋白活性后PDX-1蛋白明顯增高與CON組相比較無顯著性差異。
　　4、抗氧化劑干預
　　不同劑量褪黑素（10nM、1μM、100μM）干預間歇低氧條件下的INS-1細

17、胞顯示，隨著褪黑素劑量的增加，培養(yǎng)上清MDA的含量呈下降趨勢，與IH組相比較，MT及NAC均可降低培養(yǎng)上清MDA的含量(P＜0.01)，其中MT100uM組可將MDA降至與CON組相當?shù)乃?P＞0.05)。隨著褪黑素劑量的增加，培養(yǎng)上清SOD活力呈上升趨勢，與IH組比較，MT及NAC均可升高SOD活力(P＜0.01)，其中MT100uM組可將SOD活力提升至與CON組相當?shù)乃?P＞0.05)。
　　Western Blot對蛋

18、白進行半定量分析提示:CON組與IH組、MT10nM組、NAC組間有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;IH組與CON組、MT100μM組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); MT100μM組磷酸化JNK1表達明顯下降且與CON組無明顯差異，NAC與IH組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、間歇低氧可以誘導機體產(chǎn)生氧化應激。
　　2、間歇低氧所誘導的氧化應激通過增強JNK1mRNA表達，同時加強磷酸化JNK1蛋白的

19、表達（而非JNK2），使PDX-1蛋白表達下降（而PDX-1mRNA并未受到影響），進一步影響胰島細胞的功能。
　　3、褪黑素發(fā)揮了其強大的抗氧化作用，并通過抑制JNK1mRNA表達及JNK1磷酸化使PDX-1蛋白表達升高，進一步保護了胰島細胞的功能。
　　4、間歇低氧可以直接引起INS-1細胞氧化損傷，且這種損傷，隨著暴露時間的延長而加重。其誘導的氧化應激，可能是通過誘導JNK1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白活化而實現(xiàn)的。
　　5、